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LauraP
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 Inserito il - 02 settembre 2009 : 16:51:48
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Ciao,
ho notato una banda sdoppiata nei miei gels usando un anticorpo contro phospho S133CREB.
Io compro l'anticorpo da Upstate , ma ho visto in letteratura che lo stesso fenomeno si verifica con l'anticorpo anti phosphoS133CREB comprato da Cell Signaling.
Questo significa che la banda si sdoppia indipendentemente dall' anticorpo (rabbit o mouse, dal protocollo di preparazione dei campioni e dalle condizioni della western.
Qualcuno sa suggerirmi una spiegazione? Grazie 
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Neuroscience
Utente
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 Inserito il - 02 settembre 2009 : 17:52:08
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è capitato anche a me in una delle ultime pubblicazioni con cui ho collaborato.
Se cerchi un po' in giro, a me lo hanno detto, l'anticorpo per fosfoCREB riconosce anche un'altra proteina che può essere fosforilata, mi pare ATF-1, che ha anche una sequenza molto simile.
In pratica la tua banda CREB fosforilata è solo quella che si trova sopra. Noi per dimostrarlo al referee prendemmo gli stessi lisati e li incubammo con l'anticorpo generico per CREB. In questo modo dimostrammo che CREB era solo la banda di sopra.
Alla banda di sotto scrivemmo che è un'aspecifico e che è stata già descritta in letteratura.
In bocca al lupo
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LauraP
Nuovo Arrivato
Città: Milano
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Inserito il - 07 settembre 2009 : 10:48:17
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Grazie, ho controllato quello che mi hai suggerito ma purtroppo la banda di ATF1 e' molto piu' sotto rispetto a quella che vedo con anti fosfo CREB. Per darti un esempio di come sono le bande puoi guardare i lavori di Barlow :
Protein kinase A-mediated CREB phosphorylation is an oxidant-induced survival pathway in alveolar type II cells.
Barlow CA,et al.,
Apoptosis. 2008 May;13(5):681-92.
Loro non danno nessuna spiegazione. Puo' essere una isoforma di CREB? Non trovo proprio nulla..e devo dare una risposta ai referee di Psychopharmacology.
Ciao
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2009 : 12:56:47
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Non saprei come aiutarti, dipende da quello che hai scritto nell'articolo e da quello che ti ha chiesto il referee... il che dovrebbe essere uno scambio di informazioni strettamente privato.
io mi sono trovato in una situazione simile ed abbiamo utilizzato l'ab generico di CREB per dare corrispodenza ed è bastato. Però a noi chiesero se l'aumento della banda fosfoCREB potesse essere causato da un aumento della quantità totale della proteina, e poi c'era un discorso altezza della banda che mancava.
Noi rispondemmo con il western di CREB (che non cambia) messo vicino a fosfoCREB (che aumenta), dell'altra banda citammo una referenza che definiva a quale altezza si trova fosfoCREB.
Ora, non ricordo bene se quella banda fosse o no ATF-1, però so che è un'altra cosa, tutti la pubblicano e tutti la ignorano.
Per quanto ti riguarda, non so bene in quale contesto tu ti trovi, però sostanzialmente puoi giocare sul fatto che l'altezza di CREB è quella, che aumenta la parte fosforilata mentre la quantità totale della proteina non cambia, oppure cerchi quelle referenze che hanno utilizzato lo stesso anticorpo e citano la banda di riferimento per CREB... etc.
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LauraP
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Inserito il - 08 settembre 2009 : 10:28:40
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Trovato!
Ci sono due isoforme di CREB (alfa e delta) che differiscono per 14 amminoacidi.
Le isoforme sono espresse in maniera ubiquitaria, contengono entrambe il CRE-site e sono fosforilate entrambe dalle medesime kinasi.
La forma delta (quella piu' in basso) e' la piu' espressa in cellule adulte. Gli anticorpi disponibili in commercio non distinguono le due isoforme x questo vengono rivelate due bande.
Grazie comunque per l'aiuto
Buon lavoro
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Doppia banda pCREB WB
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