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Dionysos
Moderatore

D
Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2009 : 19:05:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno sa come posso fare per capire se un determinato
fluorocromo (nel mio caso: phycoerythrin, PE) fa spectral
overlap con un altro di colore simile (mCherry) ?

Vorrei capire se è possibile usarli assieme
per un'analisi citofluorimetrica OPPURE per una
co-immunofluorescenza su vetrino (riuscendo a
distinguere le singole marcatura dalla doppia marcatura)

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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Gabriele
Utente

Prov.: Pisa
Città: Pisa


615 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2009 : 20:06:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gabriele Invia a Gabriele un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Credo che soltanto il confronto degli spettri di assorbimento e di emissione possa chiarire la questione.

"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe."
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2009 : 20:12:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
concordo,

aggiungerei che la ricerca di qualche riferimento bibbliografico non guasterebbe...
ti consiglierei inoltre di chiamare la ditta che li vende e di chiedere a loro

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2009 : 20:13:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh dovresti andare a cercarti gli spettri di emissione.
Invitrogen ha anche un bel tool per confrontare gli spettri: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html

ma purtroppo quelli che servono a te non ci sono!
(ma potrebbe sempre esserti utile in futuro!)

Comunque nel tuo caso devi cercare gli spettri dei due composti e confrontarli:
ad es.
mCherry: spettro di emissione: http://www.bio.utk.edu/cellbiol/markers/emission.jpg


(questo è quello di eccitazione: http://www.bio.utk.edu/cellbiol/markers/excitation.jpg)

R-phycoerythrin: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/Product-Spectra.801ph75.html



Mi sembra che siano abbastanza sovrapposti comunque e non sia possibile una discriminazione.

EDIT: beh ci ho messo un po' a rispondere perchè stavo inserendo le immagini e non ho visto le risposte precedenti, comunque le risposte concordano!
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2009 : 22:22:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ricorda che anche se gli spettri non si sovrappongono puoi comunque avere color bleeding. Dipende non solo dagli spettri, ma dai filtri che usi, dall'intensità della fluorescenza (e questo è molto importante nel tuo caso visto che probabilmente non potrai controllare il livello di espressione di mCherry), dalla potenza della lampada/laser che usi etc.

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2009 : 01:24:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Urca quante cose. Io mi annoto tutto: in fondo ho un anno per imparare.

Solo un'ultima domanda: guardando lo spettro riportato da GFPina sembra
che la CFP e la GFP abbiano un overlap considerevole, EPPURE pare che in
diversi lavori (tra cui uno che conosco bene) sia stata usata una doppia
marcatura CFP + GFP senza problemi di compensazione... c'è una spiegazione
semplice/ovvia che mi sfugge??

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2009 : 09:19:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ci sono metodi di spectral deconvolution che ti permettono di separare ad es. CFP, GFP e YFP nello stesso campione.
Ad es. puoi usare il sistema META di Zeiss (ce ne sono anche altri).
In alternativa si possono usare opportune varianti delle xFP e combinazioni particolari di filtri di emissione / eccitazione. Inoltre è molto importante ricordardi che hai un aumento di bleedthrough se fai un capture dei 2 fluorofori allo stesso tempo invece di farlo in sequenza.

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2009 : 16:00:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dunque, considerando che io sono un novizio assoluto e non saprei
pianificare analisi di quel genere neppure in linea puramente teorica
(non faccio ancora l'esperimento in pratica) che ne direste a riguardo
della 'feasibility' di un'analisi FACS multipla in cellule esprimenti
contemporaneamente tutti e tre questi reporter genes:

> dGFP (destabilized green fluorescent protein)
> deltaNGFR (-> Ab PE-coniugato)
> optimized BFP (blue fluorescent protein)

(ho rinunciato alla mCherry)

Immagine:

19,92 KB

In letteratura non ho trovato riscontri

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2009 : 20:51:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, fattibile direi che è fattibile, poi dipende anche dalla combinazione di laser e filtri che usi.

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2009 : 23:38:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, thanks. Immagino che ci voglia uno strumento di ultima generazione tipo questo.

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2009 : 08:13:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dimenticavo di dire: non ho mai usato un FACS in vita mia... però alla fine che tu stia usando un confocale (quello l'ho usato!) o un FACS il principio della fluorescenza sempre quello è!

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