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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
 Inserito il - 22 settembre 2009 : 14:05:02
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Possibile che giocando con la diluizione dell'anticorpo monoclonale primario si possano avere delle distribuzioni di una certa proteina all'interno del sistema nervoso centrale del tutto diverse... es maggiore colorazione in alcune aree e meno in altre.
Il secondario che uso ha il DAB.
Ho l'impressione che a volte alcune aree diventino molto chiare ed altre molto scure quando diluisco l'anticorpo. Non so decidere la concentrazione dell'anticorpo che dia una distruzione relativa corretta della mia proteina nel SNC.
Con la diluizione che consiglia la ditta la fetta si colora quasi uniformemente di nero, cosa che non può essere possibile, so già che in determinate aree non è presente (tramite WB)
Vi ringrazio
n. 
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 22 settembre 2009 : 21:33:41
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potrebbe essere che l'antigene possa essere presente in altri distretti cellulari in quantità minore, come ad esempio un fattore di trascrizione che fa shuttling nucleo-citoplasma (e magari non è noto in letteratura).
se puoi prova a fare un blot per vedere quanto il tuo anticorpo è specifico per la proteina d'interesse e prova anche a fare un controllo negativo dell'immunifluorescenza, cioè incuba il campione solo col secondario senza il primario per vedere se è questo a legarsi in zone aspecifiche.
ciao ciao |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 07:07:53
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Lo fai sullo stesso cervello o su animali diversi?
Perchè nel secondo caso potrebbe essere variabilità inter-animale.
Prova a usare diverse diluizioni sullo stesso cervello e vedere cosa succede |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 07:48:52
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sono fettine consevutive di pochi microns dello stesso animale generalmente. Talvolta la distrbuzione si inverte. Poco espresso-> molto espresso e viceversa. Non so quale di queste diluizioni dovrei considerare giusta. Potrei considerare arbitrariamente giusta la diluizione che meglio rappresenta la quantizzazione dell'espressione fatta con il wb? E fare finta di non aver mai fisto le altre prove? Insomma capita o dovrei preoccuparmi?
n. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 08:03:38
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Hmmmm... sinceramente se fosse solamente che alcune zone appaiono a [] più alte non mi preoccuperei, ma se alcune appaiono a [] più basse mi viene da pensare che ci sia qualche problema con l'anticorpo.
La cosa è riproducibile? Nel senso, ottieni sempre le stesse zone che appaiono/scompaiono in cervelli diversi o la cosa sembra essere random?
Altra cosa che mi viene in mente è che ci potrebbero essere diverse isoforme della stessa proteina con diversa affinità per l'anticorpo (??? la vedo un po' tirata come idea ma sai mai...)
L'altra possibilità credo sia quella di fare un'ibridazione in-situ. Lo so, è uno sbattimento ma almeno avresti qualcosa con cui confrontare l'immuno (così ti confondi le idee un po' di più!!!) |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 14:24:00
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uhmm....
la cosa è riproducibile nei limiti di quello che permette la tecnica. Il trend è identico, anche se c'è un minimo di variabilità anche nel taglio delle fette.
Il fatto è che oramai ho una specie di curva dose (concentrazione di anticorpo) vs effetto (colorazione fetta)
quello che ottengo non è semplicemente una immagine più scura o più chiara. E' un po' come se si utilizzasse il contrasto della TV. Quanto più l'anticorpo è diluito, tanto più ci sono delle differenze tra le diverse aree (nero-bianco), quando metto la concentrazione consigliata dalla casa esce tutto omogeneamente uguale, pochissime differenze percettibili.
Nel range di concentrazione dell'anticorpo diluito->concentrato determinate aree possono essere chiare rispetto ad altre, poi diventare come altre, poi più scure di altre.
Di varie isoforme della proteina ce ne sono, testando con una prova crociata l'ab riconosce solo la mia proteina (WB a diverse conc di Ab sulle singole isoforme), e conosco anche l'ibridazione in situ e il western in aree specifiche. Quello che non riesco a capire è
1) se il fenomeno di variazione del risultato in funzione della [] di Ab è una cosa normale oppure no nell'immuno...
2) se la scelta dell'immagine ottenuta può essere abbastanza arbitraria, cioè cambio la [] di Ab suggerita dalla casa che me lo ha venduto per fare in modo tale che la distribuzione dell'immuno sia più compatibile con gli altri miei risultati.
Non sono certo al 100% di aver fatto un'ottima in situ e che il western possa discriminare così bene le aree.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 18:32:53
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Beh tieni presente anche che un buon anticorpo per WB non è necessariamente un buon anticorpo per immunoistochimica. (anzi in genere è abbastanza raro!) Magari il tuo anticorpo è specifico per quell'isoforma in WB ma cross reagisce anche con le altre in immunoistochimica.
Poi a parte la mia scarsa conoscenza delle aree del cervello, la cosa strana è che i risultati non siano ripetibili, cioè a volte sembra più espresso in una zona e a volte in un'altra. Io tenderei a dubitare della specificità dell'anticorpo in immuno.
Comunque sicuramente la diluizione che ti suggerisce la casa produttrice non va bene se ti colora tutto uniformemente e devi utilizzarlo più diluito, poi quale sia la concentrazione "giusta" visti i risultati non saprei. Puoi solo fare dei controlli negativi, uno con solo il secondario come diceva elly, oppure puoi provare anche su altri tessuti dove la tua proteina non dovrebbe essere espressa e vedere se realmente sono "negativi".
Puoi anche provare ad aumentare i lavaggi dopo l'anticorpo in modo da eliminare bene l'aspecifico (se è un aspecifico).
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 18:58:40
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so che si tratta di un anticorpo per immuno, e che va bene anche per il WB.
per il Wb ho utilizzato anche un altro Ab per lo stesso target ed i risultati sono gli stessi.
La ripetibilità per l'immuno è buona se utilizzo le stesse [] di Ab, stessi tempi, stesso spessore della fetta etc etc.
Escluderei che riconosca altre isoforme poiché la distribuzione di queste è molto diversa, però qualcosa di strano ci dovrebbe essere.
Per ora la distribuzione è quantomeno sicura per in situ, WB, ed altri dati di fluorescenza.
Il mio dubbio è solo su quale immagine scegliere per l'immuno. Volevo utilizzare l'immagine che conferma gli altri dati e poi scrivere nei materiali e metodi le condizioni che ho utilizzato per ottenerle. Però se è strano il fenomeno della diluizione, non vorrei trovarmi a fare un errore sperimentale ed accorgermene quando è troppo tardi.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2009 : 20:58:26
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Sinceramente a me non è mai capitato, cioè di solito la cosa è lineare: più anticorpo = labeling più forte (fino ad un certo punto, poi inizi ad avere aspecifico).
Se tuttavia, intensità a parte, le aree sono sempre le stesse e corrispondono a in-situ e WB mi preoccuperei un po' meno e terrei i dati di immuno come qualitativi e non come quantitativi.
Altre cose che potresti provare (te le dico così un po' a "ruota libera", magari non servono a nulla) sono di provare un altro fissaggio (animali perfusi o post-fissazione? PFA 4% o glutaraldeide o... ?), oppure di provare un'immunofluorescenza invece del DAB. |
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Immunoistochimica: diluizione anticorpi
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