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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
 Inserito il - 26 settembre 2009 : 19:08:05
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Sto cercando di fare immunofluorescenza su cytospin di colture cellulari, per visualizzare i centrosomi.
Le cellule sono fissate 5 minuti in metanolo e poi altri 5 minuti in acetone a -20°C per permeabilizzarle.
Effettuo il blocking per 1 ora in camera umida con PBS/BSA 2%.
I lavaggi tra anticorpi ho provato a effettuarli con PBS in agitazione per 10 minuti o nella soluzione di blocking sempre 10 minuti, solamente in quest'ultimo ho notato un fondo più pulito.
L'anticorpo primario è policlonale di coniglio, nelle pubblicazioni viene utilizzato 1:1000 a 4°C.
Ogni incubazione è effettuata sotto coprioggetto (almeno 100 microlitri).
Io ho tentato diluizioni scalari 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000 (anche a 4°C) di primario e 1:100, 1:200, 1:500 di secondario in tutte le combinazioni possibili.
Nessuna delle combinazioni mi dà uno staining veramente soddisfacente, quello che noto è che accanto ai miei segnali, ne noto numerosi altri più o meno deboli che ostacolano la valutazione, allo stesso modo ne noto altri altrettanto luminosi come i segnali "normali" presenti in zone del vetrino dove non ci sono cellule, e spessissimo tutto il vetrino sembra essere coperto da una patina opaca, un rumore di fondo omogeneo che mi impedisce perfino di capire i confini delle cellule e mi abbaglia "oscurandomi" i segnali.
Siccome non sono pratico di immunofluorescenza, sapete dirmi come evitare questa patina/rumore di fondo, e aiutarmi a capire se gli spot luminosi che vedo sono da considerarsi sempre aspecifici oppure no? Avete consigli su come ottenere una immunofluorescenza pulita?
Grazie
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2009 : 21:21:35
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Ciao Ukitel. Premetto che non ho una grandissima esperienza in IF, ma ho notato alcune differenze nel mio protocollo rispetto a quello che utilizzi tu.
Io ad esempio faccio il blocking in PBS/BSA 5%+TRITON 0,05% (è permeabilizzante... quindi aiuta a far entrare la soluz bloccante). Inoltre io filtro il PBS che uso per le IF, in modo da nn avere sporcizia nelle soluzioni che possa fare fondo.
Buona fortuna. |
Ascoltami con gli occhi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2009 : 19:17:25
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Aumenta il tempo dei lavaggi e le quantità di PBS che usi. Prova ad usare una soluzione di blocking che contenga anche saponina. La permeabilizzazione in MetOH e acetone è quella prevista dal protocollo dell'anticorpo? Io ho risolto un problema del rumore di fondo aumentando la diluizione del primario (fino a 1:200).
Nello specifico, che marker di centrosomi usi? gamma-tub? in generale, il segnale dei centrosomi non è mai molto chiaro (alla fine se ci pensi vai a vedere uno/due puntini piccolissimi), è molto frequente avere degli spot aspecifici che non consentono di individuare i CE chiaramente. ci devi un po' fare l'occhio. diverso è invece il fatto che tu veda una patina di fondo, quello non credo che sia da attribuirsi all'Ab primario, quanto al secondario o a un ridotto numero di lavaggi/tempo di lavaggio.
Io per i CE uso la gamma-tub.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Immunofluorescenza - rumore di fondo e specificità
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