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laura85
Nuovo Arrivato
106 Messaggi |
 Inserito il - 13 maggio 2006 : 15:07:54
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Sto facendo il laboratorio di biologia molecolare e sono sorte alcune domande, riguardo la pcr effettuata:
Vi chiedo se potete aiutarmi a rispondere
1.Ho usato come Dna polimerasi la Taq Gold che tipo di particolare enzima è? ha caratteristiche particolari?
2. Vi riporto i gradi e tempi della reazione di pcr sapeste dirmi a cosa corrispondono?
95° C 1 min
61°C 1 min
72°C 1 min
72°C 2 min
il tutto per 36 cicli
infine 4° 30 sec
3. scopo della pcr è stato quello di amplificare il gene ApoE di dna estratto da cellule HEK 293 (cellule umane di rene di embrione umano) e IM9 una linea tumorale umana....perchè per verificare tali tipi di DNA ho usato un gel all'1.5 %?
mentre lo stesso DNA è stato anche sottoposto a digestione con enzimi di restrizione e lì ho usato un gel d'agarosio allo 0.8 %?
4. su gel per fare la PCR ho caricato 500 ng per il dna genomico ( di HEK 293 e IM9 ) e 100 ng di dna plasmidico che ha una lunghezza di circa 3000 basi. Perchè una tale scelta? e quante copie del gene (apoE) sono presenti se ho caricato 500 ng e 100 ng?
5. Come si determina la temperatura di annealing per fare una pcr?
6. per amplificare il gene ApoE ho usato dei primer che erano complementari a tale gene, però le prime 7 basi non lo erano....è come se avessi usato una 'codina' di 7 basi non complementari, mentre le restanti basi lo erano...perchè una tale scelta??
RINGRAZIO IN ANTICIPO CHIUNQUE MI SAPPIA RISPONDERE
SPERO DI ESSERE STATA CHIARA NEL SPIEGARE CIò CHE HO FATTO IN LAB E LE MIE DOMANDE!
BACI A TUTTI!
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marcocatucci
Nuovo Arrivato
Prov.: Estero
Città: Leeds, England
19 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2006 : 17:45:57
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Cara Laura,
fai bene a porti tutte queste domande.
Senza queste informazioni, quello che stai facendo resterebbe
una semplice e sterile applicazione dei protocolli,
senza capirne il senso.
Anch'io lavoro con la pcr, ma utilizzo delle condizioni un po diverse.
Ci sono delle regole che valgono per tutte le pcr,
ma molto spesso le condizioni sperimentali vengono variate
a seconda del particolare esperimento.
Il primo consiglio che mi sento di darti è quello
di chiedere aiuto al tuo supervisore.
Avrebbe dovuto spiegarti tutte queste cose che tu chiedi...
Coloro che lavorano nel tuo laboratorio ed utilizzano la stessa
tua tecnica dovrebbero sapere tutte queste cose.
L'altro modo per avere informazioni e quello di leggere
i protocolli allegati ai reagenti che utilizzi.
Infatti a seconda della casa produttrice, i reagenti
hanno delle caratteristiche differenti.
buon lavoro |
Marco
W la Ricerca! |
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laura85
Nuovo Arrivato
106 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2006 : 18:04:43
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grazie!
però la 'cosa' brutta è che queste domande le ha poste proprio il nostro prof per vedere se noi riusciamo a rispondere......e ha detto che ci aiuterà a risp solo se avremo tempo.....quindi ho chiesto aiuto a voi!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2006 : 00:45:36
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Innanzitutto dai un occhio a Wikipedia.
Per rispondere alle tue domande:
1) Taq Gold e' un nome commerciale per una Taq polimerasi con prestazioni migliorate (e costo piu alto) rispetto alla Taq classica. Fanno anche la Taq Platinum e altri tipi. Se non ricordo male Taq Gold e' legata ad una molecola che la inibisce fino al primo passaggio a 95 gradi, ed e' quindi ottima per fare RT-PCR (ma va bene anche per la PCR normale come nel tuo caso), in quanto puoi fare la retrotrascrizione e la PCR nella stessa provetta direttamente (oppure aggiungi la Taq alla fine della retrotrascrizione). Diciamo cmq che per il tuo esperimento probabilmente una Taq valeva l'altra.
2) Il ciclo che avete usato e' abbastanza standard:
95° C 1 min <-- denaturi il DNA, quindi avrai i 2 filamenti separati
61°C 1 min <-- temperatura di annealing dei primers (un po' alta a dir la verita'... ma dipende dai primers!)
72°C 1 min <-- step di sintesi del nuovo DNA
72°C 2 min <-- ?? come sopra... non so perche' 2 volte!
il tutto per 36 cicli <-- 36 cicli ti permettono di avere un buon numero di copie di DNA
Generalmente si fa anche un primo passaggio di 2-3' a 95° per fare una prima buona denaturazione del DNA e poi un ultimo passaggio di una decina di minuti a 72°, ma non so quanto influenzino la buona riuscita dell'esperimento!
In generale non si fanno mai piu' di 40 cicli, perche' cominci ad amplificare aspecificamente.
3) La % del gel dipende dalla lunghezza dei frammenti che vuoi visualizzare, che dipende dai primer che usi.
Questa tabellina potrebbe tornarti utile
% (range in bp)
0,3 60.000 - 5.000
0,6 20.000 - 1.000
0,7 10.000 - 800
0,9 7.000 - 500
1,2 6.000 - 400
1,5 4.000 - 200
2,0 3.000 - 100
Per frammenti piu piccoli (o se vuoi confrontare frammenti che differiscono solo per poche bp) si usa la poliacrilammide invece dell'agarosio.
4) La quantita' di DNA caricato sara' stata determinata sperimentalmente in modo che la PCR funzionasse bene, non credo ci siano regole precise, ma magari qualcuno mi sa illuminare a riguardo.
Comunque troppo poco DNA ti porterebbe a una resa minore (e possibilmente ad una maggiore amplificazione aspecifica). Troppo DNA, d'altra parte, potrebbe inibire la reazione.
5)In generale quando disegni i primer lo fai con un programma che ti calcola la T di annealing. Questa in generale e' 5 gradi sotto la T di melting dei primers, ma si puo' poi modificare se la PCR non da' buoni risultati. In particolare se hai troppo aspecifico aumenti la T annealing, se hai poco prodotto la diminuisci.
Vedi qui e qui per un discorso piu' completo.
Un esempio di programma per trovare i primers e' Primer3:
www.cgi" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi (non prende il link correttamente... dovrai riscriverlo a mano!)
6) Puo' essere utile ad esempio per clonare l'amplificato in un plasmide. Infatti, se la coda e' complementare alle estremita' di un plasmide linearizzato, potrai semplicemente incubarli insieme con un po' di ligasi et voila'! Il plasmide e' pronto! 
Wow! Ho risposto a tutto!!  |
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laura85
Nuovo Arrivato
106 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2006 : 12:01:26
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che dire?
GRAZIE INFINITE!!! |
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Buonocore10
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2017 : 16:02:18
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| scusate un piccolo aiuto x piacere!!!!! dal punto di vista didattico non capisco questo aspetto della PCR......Quando effettuo una PCR su una sequenza bersaglio che decido di amplificare esponenzialmente in vitro,devo conoscere le sequenze fiancheggianti il mio frammento che nn sono quelle esterne al mio templato ma i nucleotidi di inizio e fine di esso,giusto???.......dopo che la TAQ POLIMERASI inizia a svolgere il suo ruolo,in realtà otterrò anche l amplificazione delle sequenze fuori il mio templato perchè l enzima aggiunge nucleotidi a tutta la stringa stampo e non solo alla mia sequenza bersaglio....giusto???Grazie |
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