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cino
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20 Messaggi |
 Inserito il - 13 novembre 2009 : 17:57:07
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Ciao ragazzi.. ho un piccolo problemino.. sto sudiando la tecnica di sequenziamento del dna. Assodate le differenze fra un deossinucleotide e un dideossinucleotide, e kiaramente quali sono i loro effetti, c'è qualcuno ke mi può illustrare la tecnica cn l esperimento delle 4 provette?( ovvero miscela di dna, primer,polimerasi e x ogni provetta un dideossinucleotide specifico)
ringrazio anticipatamente
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bibi86
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 13 novembre 2009 : 21:39:55
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Ciao credo tu ti stia riferendo al metodo metodo dei dideossi di Sanger. Tale metodo è basato sulla sintesi enzimatica di molecole di DNA che terminano in corrispondenza di specifici nucleotidi. L’idea che sta alla base del metodo Sanger è di produrre tutte le possibili molecole di DNA a filamento singolo, complementari a una sequenza stampo che costituisce il DNA che si desidera sequenziare, che inizia con una base e che si estende fino a una distanza di 1 kb in direzione 3’. Reazione di polimerizzazione che si arresta specificamente dopo ogni G oppure dopo ogni A o T o C. L’arresto specifico si ottiene aggiungendo alla reazione di polimerizzazione dei dideossinucleotidi trifosfati (ddNTP).
Con questa tecnica viene preso una molecola di DNA a singolo filamento e viene legata all’estremità 5’ ad un oligonucleotide sintetico, marcato o con un radio marcante o con un fluoro cromo, che funge da innesco. Per le estremità 3’ il discorso è un po’ più complesso. Nella miscela di reazione vengono aggiunti, oltre ai normali nucleotidi, un dideossinucleotide anch’esso marcato, ovvero un nucleotide privo di gruppo ossidrile sia all’estremità 3’ che 2’(sia al 3’ che al 2’ c’è un atomo di H). I dei deossinucleotidi sono aggiunti in una proporzione 1:100 rispetto agli altri nucleotidi normali (deossinucleotidi), ovvero su 100 nucleotidi, 99 sono deossinucleotidi, 1 è dideossinucleotide. Ogni qualvolta viene incorporato nella molecola di DNA un dideossinucleotide, l’allungamento della molecola di DNA si arresta poiché non vi è più un gruppo OH con cui legare il nucleotide successivo. Pertanto ogni molecola di DNA inizia con un oligonucleotide marcato all’estremità 5’, e termina con un dideossinucleotide marcato all’estremità 3’. Posto che nella miscela di reazione viene messo un solo tipo di dideossinucleotide, cioè solo A o solo C o solo G o solo T, e visto che tutte le molecole iniziano dallo stesso punto corrispondente all’oligonucleotide posto all’estremità 5’ della molecola, le varie molecole di DNA prodotte avranno lunghezze diverse dovute al fatto che si interromperanno in posizioni diverse a seguito dell’incorporazione in posizioni casuali di un dideossinucleotide. Se ad esempio mettiamo in una miscela di razione tutti i nucleotidi e mettiamo poi solo il ddGTP e facciamo avvenire la sintesi del DNA le molecole di DNA saranno tutte di varie lunghezze ma tutte si interromperanno solo in presenza di G, quindi saremo certi che in quelle posizioni si trova una G. La miscela di reazione deve poi essere sottoposta ad elettroforesi in gel di poliacrilammide, in modo da separare i frammenti di DNA in base alla loro lunghezza. Poiché la policarilammide è in grado di separare molecole che differiscono anche solo per una base è possibile sapere esattamente quanto è lunga una molecola, quindi è possibile esattamente sapere dove si è interrotto l’allungamento quindi sapere la posizione della G. poiché da un siffatto processo si ottiene una miscela di molecole interrotte in tute le posizioni in cui si trova la G sapremo esattamente dove si trova la G in tutta la molecola di DNA, ripetendo un tale processo per gli altri tre nucleotidi avremo la posizione di tutti i nucleotidi, avendo così la sequenza nucleotidica corretta di tutta la molecola in esame. Tale tecnica ha il limite di essere applicabile solo per brevi sequenze di DNA.
Spero di esserti stato di aiuto!
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cino
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20 Messaggi |
Inserito il - 14 novembre 2009 : 13:48:55
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| siii! grazie mille! avevo degli appunti ma non erano x nulla kiari! |
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