| Autore |
Discussione |
|
|
cino
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
 Inserito il - 16 novembre 2009 : 15:44:58
|
salve a tutti
visto ke trovo ancora quache difficoltà a capire questa tecnica spero ci sia qualcuno ke mi possa fare un esempio pratico.
se io voglio sequenziare un frammento (facciamo piccolissimo) 20 paia di basi, so di per certo ke devo inanzitutto inserire il primer specifico e marcato ke si leghi all estremità 5' e poi un dideossinucleotide, ank'esso marcato, per fare arrestare la reazione.. facciamo che inserisco un ddGTP.
adesso marerialmente cosa succede appena parte la reazione????
|
|
|
|
|
memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2009 : 15:58:36
|
Quando parte la reazione la DNA polimerasi comincia ad inserie i nucleotidi complementari a quelli presenti sullo stampo. Nel momento in cui incontra una C dovrà inserire una G, ma nella mix sono presenti due diversi nucleotidi, sia i deossi che i dideossi. Se inserisce il deossi la reazione procede normalmente, se inserisce il dideossi si arresta. Il fatto che inserisca uno o l'altro è un evento casuale, per cui terminata la reazione avrai un pool di frammenti che si sono arrestati in punti differenti, relativamente all'inserimento del nucleotide dideossi, ma che presumibilmente dovrebbero essere in grado di aver coperto tutto il tup frammento. Facendo una classica gel elettroforesi separi i singoli frammenti. Affiancando le quattro mix, nelle quali in ciascuna è presente un differente nucleotide dideossi, sei in grado di leggere la sequenza del filamento che stai sequanziando, ovviamnete la complementare.
Spero di essere stata chiara
 |
 |
|
|
cino
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2009 : 16:12:07
|
si ma..se parte la polimerasi e già dopo aver sttaccato un nucleotine incontra una C nello stampo la reazione si ferma e non riparte piu?
quindi un "frammento" cn un solo nucleotide???? |
|
|
|
cino
Nuovo Arrivato
20 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2009 : 21:02:46
|
| un aiutino please... |
|
|
|
memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2009 : 09:10:03
|
| non riparte più per quello specifico frammento in cui si è inserito il dideossi. nei frammenti in cui inserisce il deossi la reazione non si ferma ma va avanti tranquillamente. |
|
|
| |
Discussione |
|
esempio di sequenziamento dna cn sanger
Didattica e Relazioni
