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buccia
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 04 dicembre 2009 : 14:49:28
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Ciao a tutti, sto facendo degli studi sullo stress ossidativo nelle cellule di neuroblastoma Sk-n-BE e SH-SY5Y. Vorrei ottenere delle immagini di fluorescenza usando la DicloroFluorosceina (DHCFA). Però ho scoperto che non è possibile ottenere delle immagini usando le normali piastre e pozzetti su cui crescono le cellule di neuroblastoma.
Per ora le uniche ipotesi che mi sono venute in mente sono 2: 1. utilizzare un supporto da inserire nel pozzetto (però nel mio laboratorio non ne possiedono); 2. oppure utilizzare i vetrini.
La seconda opzione mi pare la più economica.
La mia domanda è questa: è possibile far crescere le cellule di neuroblastoma su un vetrino copri oggetto messo dentro un pozzetto (io utilizzo piastre da 6 pozzetti)? Oppure se non è possibile, posso staccare le cellule, metterle sul vetrino e poi aggiungere la sonda?
Spero di essermi spiegato bene.
Ringrazio chiunque mi darà una mano.
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2009 : 15:13:57
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ciao!
non ho mai fatto immunofluorescenza con DHCFA, quindi non so che condizioni di coltura tu debba usare, però con altri sistemi mi sono trovata bene utilizzando dei vetrini per colture in cui puoi far crescere le cellule e successivamente fissarle e colorarle in modo molto rapido e diretto, alla fine devi solo rimuovere i bordi dei pozzetti e montare il coprioggetto... in commercio ce ne sono di varie misure, 2, 6 e 8 chamber, però generalmente i pozzetti sono più piccoli rispetto alle normali multiwell.
un altro sistema è quello di piastrare le cellule normalmente, staccarle e farle aderire a dei vetrini coprioggetto su cui dovresti aver preparato un coating di polilisina, è un metodo non troppo complesso e ti permette di mantenere le tue normali condizioni di coltura... |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 05 dicembre 2009 : 09:55:12
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Cami hai dato la risposta che avrei dato io  d'accordissimo con te ;)
Aggiungerei che non so se il neuroblastoma potrebbe preferire un coating diverso dalla polilisina! In ogni caso proverei con polilisina e se le cell non aderiscono passerei ad altri coating (collagene, etc).
Inoltre non so se qsti coating potrebbero dare fondo con il tipo di fluorescenza che devi fare tu (in alcuni casi capita). |
Ascoltami con gli occhi... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2009 : 23:36:05
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| a me sembra che crescano bene anche su plastica..così risolvi il problema alla radice |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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buccia
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2009 : 16:57:09
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Vi ringrazio, domani proverò a proporre queste tecniche in laboratorio, vediamo cosa salta fuori.
Grazie ancora. |
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buccia
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2009 : 12:01:44
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In laboratorio hanno risposto favorevolmente a provare la metodica con il collagene. Adesso però sorge questo problema: qualcuno sa esattamente il procedimento da adottare?
Io penso di aggiungere il collagene direttamente sul vetrino, ma non so nè a quale concentrazione nè le tempistiche.
Come sempre vi ringrazio per qualsiasi aiuto. |
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cescaB
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2009 : 15:26:52
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Ciao,
noi abbiamo usato molto neuroblastoma per immunofluorescenza, anche se non quelle linee. In effetti amano il collagene, soprattutto se si induce il differenziamento, noi usavamo il tipo I o III, (soluzione 100 microg/ml), da deporre sul vetrino per 6-8 ore, poi aspirare (possibile utilizzare di nuovo la soluzione di collagene 2 volte), sciacquare in PBS (per eliminare residui acido acetico della soluzione) un paio di volte e infine piastrare le cellule (magari lasciandole fermare sul vetrino prima di aggiungere tutto il terreno di coltura). In bocca al lupo!
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