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Discussione

nuna
Nuovo Arrivato

48 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2010 : 21:00:37

salve ragazzi,
in lab mi hanno dato delle sequenze da analizzare.
Sono per la PCR.
Mi hanno detto che sono primers foreward e reverse e la sequenza genica da amplificare.
Mi dareste delucidazioni?
Cosa sono i primers reverse e foreward? A che sequenza si appaiono?
Grazie

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 20 gennaio 2010 : 00:12:59

I primers sono gli "ineschi" che si attaccano alla sequenza da amplificare:
- primer forward (non foreward!) o "senso" ("sense" in Inglese) si attacca alla sequenza "non codificante" (� quindi uguale alla sequenza codificante per questo � detto senso)
- primer reverse o "antisenso" ("antisense" in Inglese) si attacca alla sequenza "codificante"

Esempio:
Sequenza

CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT
AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG
CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGGGCCGTGTTCCCGTCC
ATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGGCGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAAGATTCCTACGTGGGCGACG
AGGCTCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCTATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGA
TGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTTCGCGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCACC
CTGCTCACCGAGGCCCCCCTCAATCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCT
TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG

a doppio filamento hai:


CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT
GGTGGCGTCGCCTGTCGCGGTTCACTTCGGAGCGAAGGGGAGGCGCCGCTGGTCCCGGGCTCGGCTCTCA

AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG
TCGTCAACATCGATGGGCGGGTCTTTGATCTGTGTTACACGCTGCTTCTGCTCTGGTGGCGGGAGCACAC

CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGGGCCGTGTTCCCGTCC
GCTGTTACCGAGGCCGGACCACTTTCGGCCGAAGCGGCCCCTACTGCGGGGATCCCGGCACAAGGGCAGG

ATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGGCGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAAGATTCCTACGTGGGCGACG
TAGCACCCGGCGGGGGCTGTGGTCCCGCAGTACCAGCCATACCCAGTCTTTCTAAGGATGCACCCGCTGC

AGGCTCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCTATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGA
TCCGAGTCTCGTTCTCTCCATAGGACTGGGACTTCATGGGATAGCTCGTGCCGTAGTAGTGGTTGACCCT

TGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTTCGCGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCACC
ACTGTACCTCTTCTAGACCGTGGTGTGGAAGATGTTGCTCGAAGCGCACCGAGGGCTCCTCGTGGGGTGG

CTGCTCACCGAGGCCCCCCTCAATCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCT
GACGAGTGGCTCCGGGGGGAGTTAGGGTTCCGGTTGGCGCTCTTCTACTGGGTCTAGTACAAACTCTGGA

TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG
AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC

I primer saranno ad esempio quelli segnati:


CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT

CCACCGCAGCGGACAGCGC (primer forward)
GGTGGCGTCGCCTGTCGCGGTTCACTTCGGAGCGAAGGGGAGGCGCCGCTGGTCCCGGGCTCGGCTCTCA

AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG
TCGTCAACATCGATGGGCGGGTCTTTGATCTGTGTTACACGCTGCTTCTGCTCTGGTGGCGGGAGCACAC

CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGGGCCGTGTTCCCGTCC
GCTGTTACCGAGGCCGGACCACTTTCGGCCGAAGCGGCCCCTACTGCGGGGATCCCGGCACAAGGGCAGG

ATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGGCGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAAGATTCCTACGTGGGCGACG
TAGCACCCGGCGGGGGCTGTGGTCCCGCAGTACCAGCCATACCCAGTCTTTCTAAGGATGCACCCGCTGC

AGGCTCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCTATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGA
TCCGAGTCTCGTTCTCTCCATAGGACTGGGACTTCATGGGATAGCTCGTGCCGTAGTAGTGGTTGACCCT

TGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTTCGCGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCACC
ACTGTACCTCTTCTAGACCGTGGTGTGGAAGATGTTGCTCGAAGCGCACCGAGGGCTCCTCGTGGGGTGG

CTGCTCACCGAGGCCCCCCTCAATCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCT
GACGAGTGGCTCCGGGGGGAGTTAGGGTTCCGGTTGGCGCTCTTCTACTGGGTCTAGTACAAACTCTGGA

TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG
AGTTGCACGGGCGGTACA (primer reverse)

AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC

FaFa86
Nuovo Arrivato

8 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2010 : 18:46:23

scusate se mi intrometto..... ma lo stesso esercizio che hai fatto proprio qui....se ci metti 3' e 5' davanti alle sequenze?
dovrebbe essere cos�?

5'-CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT
AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG
CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGGGCCGTGTTCCCGTCC
ATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGGCGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAAGATTCCTACGTGGGCGACG
AGGCTCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCTATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGA
TGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTTCGCGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCACC
CTGCTCACCGAGGCCCCCCTCAATCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCT
TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG -3'

oppure prima 3' davanti e poi 5' alla fine?
cio�: chi � senso e chi � antisenso?
senso = codificante = 5'...........3' oppure 3'.........5'?
grazie mille!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 23 gennaio 2010 : 20:17:22

Le sequenze si leggono "sempre" da 5' a 3', quindi quella segnata � la sequenza codificante (o senso) (5'-3') mentre l'altra (quando ho messo il doppio filamento) � quella non codificante (o antisenso) (3'-5').
Quindi s� � come hai segnato tu:

5'-CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT
   AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG
   CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGGGCCGTGTTCCCGTCC
   ATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGGCGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAAGATTCCTACGTGGGCGACG
   AGGCTCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCTATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGA
   TGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTTCGCGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCACC
   CTGCTCACCGAGGCCCCCCTCAATCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCT
   TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG -3'

e quella a doppio filamento (e con primer) sarebbe:


5'-CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT

5'-CCACCGCAGCGGACAGCGC-3' (primer forward)
3'-GGTGGCGTCGCCTGTCGCGGTTCACTTCGGAGCGAAGGGGAGGCGCCGCTGGTCCCGGGCTCGGCTCTCA

   AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG
   TCGTCAACATCGATGGGCGGGTCTTTGATCTGTGTTACACGCTGCTTCTGCTCTGGTGGCGGGAGCACAC

   CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGGGCCGTGTTCCCGTCC
   GCTGTTACCGAGGCCGGACCACTTTCGGCCGAAGCGGCCCCTACTGCGGGGATCCCGGCACAAGGGCAGG

   ATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGGCGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAAGATTCCTACGTGGGCGACG
   TAGCACCCGGCGGGGGCTGTGGTCCCGCAGTACCAGCCATACCCAGTCTTTCTAAGGATGCACCCGCTGC

   AGGCTCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCTATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGA
   TCCGAGTCTCGTTCTCTCCATAGGACTGGGACTTCATGGGATAGCTCGTGCCGTAGTAGTGGTTGACCCT

   TGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTTCGCGTGGCTCCCGAGGAGCACCCCACC
   ACTGTACCTCTTCTAGACCGTGGTGTGGAAGATGTTGCTCGAAGCGCACCGAGGGCTCCTCGTGGGGTGG

   CTGCTCACCGAGGCCCCCCTCAATCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCT
   GACGAGTGGCTCCGGGGGGAGTTAGGGTTCCGGTTGGCGCTCTTCTACTGGGTCTAGTACAAACTCTGGA

   TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG-3'
3'-AGTTGCACGGGCGGTACA-5' (primer reverse)

   AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC- 5'

FaFa86
Nuovo Arrivato

8 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 11:59:24

ma se io ti dicessi:
5'-CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT-3'
3'-GGTGGCGTCGCCTGTCGCGGTTCACTTCGGAGCGAAGGGGAGGCGCCGCTGGTCCCGGGCTCGGCTCTCA-5'

i primers alcuni amici mi hanno detto che sono :
forward: 5'-CCACCGCAGCGGACAGCGCC-3'
reverse: 5'-ACTCTCGGCTCGGGCCCTGG-3'

Ho chiesto a due persone diverse e entrambe me li hanno scritti cos� (indipendentemente)......

Grazie mille per le risposte

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 12:10:02

E dov'� la differenza scusa?

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FaFa86
Nuovo Arrivato

8 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 14:16:33

la sequenza l'ho cambiata leggermente.... vedi bene
Fai finta che la sequenza nostra adesso � questa che t'ho scritto.... dammi conferma che i primers sono quei due se puoi :)
grazie

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 14:39:54

s�, quelli sono 2 primers che amplificherebbero quella sequenza

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FaFa86
Nuovo Arrivato

8 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 14:40:40

grazie assai

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 14:54:52

Nota che i primers per amplificare una sequenza non devono per forza essere all'estremit� della sequenza (a meno che tu non debba amplificarla per forza tutta)

Quindi riprendendo il mio esempio (metto solo il reverse), puoi avere questo che avevo disegnato prima:

   TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG-3'
3'-AGTTGCACGGGCGGTACA-5' (primer reverse)

   AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC- 5'

Ma anche questo:

   TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG-3'
                                 (primer reverse)   3'-GAGGCCGTCCTGGTGGCC-5' 

   AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC- 5'

Sono entrambi primers validi (come ce ne possono essere molti altri su quella sequenza).

FaFa86
Nuovo Arrivato

8 Messaggi

Inserito il - 24 gennaio 2010 : 15:20:22

ok!grazie mille ^_^ ora � chiaro ;)

stella 86
Nuovo Arrivato

35 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2010 : 11:28:05

invece il mio professore fa delle modifiche ai primer per far si che la temperatura di melting dei due primer siano tra 59 max 62 �C ...ed � li che mi sorgono tanti dubbi perche' nn ho capito come modificare la mia sequenza!!poi tipo dice che i primers nn devono terminare con C G ..mi aiutereste ?? vorrei un esempio pratico alla teoria del prof...GRAZIE !

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 28 gennaio 2010 : 13:53:37

Beh ci stiamo girando un po' in torno!
� esattamente quello che dicevo qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=16312
leggiti bene le regole per il disegno dei primers che ti ho linkato!
Poi prendi una sequenza (ad es. quella che ho messo qui) e provi a disegnarti dei primers tenendo conto di quelle caratteristiche!

Io ho detto fin da subito che questo esempio era solo per avere un idea di "cosa" fossero i primer forward e reverse e do certo non sono i primer migliori, ma delle sequenze che ho scritto "assolutamente a caso".

Se il primer deve terminare con G o C basta che lo fai ternmira con G o C, non c'� molto da capire.
Riprendendo l'esempio di prima: il primer forward da questo punto di vista va bene:


5'-CCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGT

5'-CCACCGCAGCGGACAGCGC-3' (primer forward)
-3'-GGTGGCGTCGCCTGTCGCGGTTCACTTCGGAGCGAAGGGGAGGCGCCGCTGGTCCCGGGCTCGGCTCTCA

finisce con una C.

Il primer reverse invece non va bene:

   TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG-3'
3'-AGTTGCACGGGCGGTACA-5' (primer reverse)

   AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC- 5'

perch� finisce con una A, ma basta ad es togliere l'ultima base e finisce con una G!

   TCAACGTGCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTCTACGCCTCCGGCAGGACCACCGG-3'
 3'-GTTGCACGGGCGGTACA-5' (primer reverse)

   AGTTGCACGGGCGGTACATGCACCGGTAGGTCCGGCACGACAGGGAGATGCGGAGGCCGTCCTGGTGGCC- 5'

poi ti calcoli la Tm e controlli che vada bene, la lunghezza del primer... ecc...

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