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citosina83
Nuovo Arrivato
Prov.: enna
Città: enna
22 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2010 : 20:49:54
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Help me....ho un problema.....Devo detectare due proteina a bassissimo peso molecolare, la neurturina (12KDa)e il GDNF. Inizialmente ho fatto un gel al 12% e non ho ottenuto la banda attesa...Poi il Prof, mi disse di provare con una percentuale di gel più alta, al 15%.....risultato:un vero disastro....il gel ha corso malissimo e poi credo che abbia polimerizzato male, c'erano delle bolle.... e per finire la banda a 10KDa dopo 3h di blot verticale a 60Volt cost per 3h, non si è trasferita; adesso devo ripetere la stessa procedura per il GDNF (15KDa) e sinceramente penso che si ripeterà ciò che mi è successo per la neurturina!perchè tutto questo?il Prof dice eventualmente di allungare il voltaggio o il tempo di trasferimento, ma io temo anche che lo scorrimento vada male!riuscite a darmi qualche consiglio?io parto da estratti tissutali.
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2010 : 17:30:36
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io ho usato spesso gel al 15% e no ho mai avuto problemi... considera che io faccio tutta la corsa a 150V e poi trasferisco su nitrocellulosa a 100V per 1 ora... l'unica cosa a cui devi fare attenzione è non far uscire la tua banda, anche perchè può capitare che il marker prestained non corra esattamente come viene scritto nel datasheet, a volte le bande possono essere leggermente più alte o più basse del previsto, quindi se devi far correre molto il gel ti conviene lasciare un po' di margine in modo da non perderti la tua proteina...
in genere il gel al 15% polimerizza più in fretta ed è più resistente, quindi forse il tuo problema è stato dovuto a un po' di sfortuna nella preparazione di quello che hai usato, inoltre in genere sono le bande alte che non si trasferiscono bene, mentre credo che la tua fosse abbastanza bassa, forse anche questo problema è imputabile alla qualità del gel... |
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molecola84
Nuovo Arrivato
Prov.: ol
Città: ugan
88 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 17:28:02
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ma perchè fai correre il gel per 3 ore? ricorda che quelle a basso pesomolecolare escono prima dal gel...quindi dovesti stare attenta a non farla uscire e quindi a non farlo correre + di un'ora anche a 120V secondo me...
il gel provalo a fare al 15%, ma il giorno prima. Poi lo conservi impacchettato. umido e in frigo...il giorno dopo se sei stata attemta avrà plimerizzato bene.
altrimenti devi farti i gel grandi... |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 23:17:46
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si anche secondo me ti conviene lavorare su un gel grande. hai due vantaggi, il primo è che separi bene le bande e il secondo è che sei sicura di non perdere quelle a 15 KDa. se hai a disposizione dei low range marker usali al posto dei full range così segui ancora meglio la corsa. secondo me il problema non è il tempo di trasferimento ma come hanno detto prima, hai avuto problemi con il gel. in bocca al lupo  |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
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gel 15%
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