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lorettabolgan
Nuovo Arrivato
Prov.: venezia
Città: dolo
6 Messaggi |
 Inserito il - 25 febbraio 2010 : 16:22:24
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avrei bisogno di un aiuto: quando faccio il ficoll per separare i linfociti, l'anello è contaminato da globuli rossi; sottolineo che i reagenti sono a t° ambiente (20-25°C) e centrifugo a 400g per 30 min.
Vi ringrazio per l'aiuto!
Loretta
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 16:26:23
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| Prova a lisarli con una soluzione di NH4Cl allo 0,4% preparato in Tris HCl pH 7,4. |
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lorettabolgan
Nuovo Arrivato
Prov.: venezia
Città: dolo
6 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 17:02:43
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ti ringrazio per la risposta.
Però non capisco quando devo aggiungere la soluzione lisante? Dopo il ficoll non è possibile perchè l'anello non è possibile raccoglierlo perchè i globuli rossi formanon un aggregato che probabilmente precipita gran parte dei linfociti (nei lavaggi successivi non si forma alcun precipitato...); prima del ficoll devo lisare, centrifugare e diluire con EDTA?
Ciao e grazie
Loretta |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 17:14:10
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Io dopo che prelevo i linfociti faccio tre lavaggi con PBS e poi una incubazione di 10 minuti con il lisante, dopo di che ricentrifugo. Le emazie te le porti comunque dietro come contaminanti, è difficile non averle. Prova a fare così. Posso chiederti che medium di separazione usi?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 17:19:14
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Citazione:
Messaggio inserito da lorettabolgan
Integro il messaggio precedente con altri dettagli:
il sangue che uso è prelevato fresco con anticoagulante citrato di sodio.
Lo diluisco 1:1 con una soluzione fisiologica di EDTA e lo stratifico su Ficoll-paque-Plus in rapporto 1:1; centrifugo a 400 g per 30 min.
La soluzione di EDTA e il ficoll sono a t°C ambiente (tra i 20-25°C).
Ho provato a centrifugare a 1000g per 30' e l'anello si separa molto bene, ma non so se in questo modo viene compromessa la vitalità dei linfociti.
Il problema è che l'anello risulta molto inquinato di globuli rossi, che mi impediscono il recupero dei linfociti.
Vorrei sapere inoltre se possono essere usati anche altri coagulanti come EDTA o eparina, o se interferiscono con la separazione.
Ringrazio tutti fin d'ora per l'aiuto!!
Loretta
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 17:20:23
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grazie GFPina!!! Così viene più facile leggere e rispondere  |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 17:25:30
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Provo a dirti cosa faccio io. Innanzitutto lavoro con buffy coat, e questo dovrebbe agevolarmi (uso il condizionale perchè il sangue è sempre molto inquinato). Poi stratifico su Lympholyte H. Il cuscinetto che ottengo è sempre inquinato ma con la lisi osmotica che faccio di solito riesco a purificarlo abbastanza bene e le cellule sopravvivono abbastanza.
Altre informazioni non sono in grado di dartene visto che ho lavorato sempre e solo così
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lorettabolgan
Nuovo Arrivato
Prov.: venezia
Città: dolo
6 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 22:11:35
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Citazione:
Messaggio inserito da memole
Io dopo che prelevo i linfociti faccio tre lavaggi con PBS e poi una incubazione di 10 minuti con il lisante, dopo di che ricentrifugo. Le emazie te le porti comunque dietro come contaminanti, è difficile non averle. Prova a fare così. Posso chiederti che medium di separazione usi?
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lorettabolgan
Nuovo Arrivato
Prov.: venezia
Città: dolo
6 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 22:23:11
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come mezzo di separazione uso il ficoll-paque plus e faccio lavaggi in PBS.
Vi ringrazio per le vostre risposte.
Ciao
loretta |
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lorettabolgan
Nuovo Arrivato
Prov.: venezia
Città: dolo
6 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2010 : 08:54:51
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ieri ho fatto una prova di separazione in ficoll per vedere di eliminare i globuli rossi dall'anello di linfociti e il risultato ottimale è stato di centrifugare per 20 min. a 1000g, i rossi che rimmangono sono trascurabili ed eventualmente eliminabili con la soluzione di cloruro di ammonio.
Ciao e grazie |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 03 marzo 2010 : 11:42:35
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Mi fa piacere per te. Buon lavoro
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ficoll
Didattica e Relazioni
