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SMO
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11 Messaggi |
 Inserito il - 06 aprile 2010 : 10:47:19
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ciao a tutti...:-)
devo identificare dele proteine idrofobiche da un eluito di una cromatografia per affinità
(ho un peptide e cercho il suo ligando)
correndo l'eluito in sds page riesco a fare la massa (spettrometro), di alcune proteine, ma non di quelle idrofobiche.
qualcuno di voi per caso conosce qualche metodo che mi permetta di "purificare" le proteine idrofobiche permettendomi di averne una quantità adatta per poterle identificare con lo spettrometro di massa???
spero mi possiate dare una mano.... :-)
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metionina
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45 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2010 : 23:37:39
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ciao!
anch'io lavoro con una proteina idrofobica e i problemi sono sempre molti!
non capisco una cosa, ma le vedi su sds-page queste proteine idrofobiche? o tutte le bande che vedi su sds-page le identifichi come proteine solubili con lo spettrometro di massa?
sono proteine inserite in membrana?
e cosa carichi sulla colonna di cromatografia? |
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SMO
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2010 : 21:26:24
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ciao :-)
carico un lisato cellulare..e tt le bande "tagliabili" lo spettrometro me le identifica cm proteine solubili oppure mi "dice" che nn c'è "abbastanza materiale"...
come posso fare secondo te??
:-)
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metionina
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Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:16:24
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Ti do delle idee forse un po' stupide, immagino che tu ci abbia già pensato, ma provo comunque! 
Le proteine membranali restano in teoria nei corpi di inclusione dopo lisi cellulare, ma spesso restano anche numerose nei detriti insolubili. Hai provato a caricare anche quelli sulla tua colonna? L'isolamento di proteine idrofobiche necessita sempre l'uso di detergenti in ogni fase per evitare che le proteine si aggreghino e precipitino. Hai provato a usare dei detergenti nella tua fase di eluizioni dalla colonna? La proteina che cerchi sai quanto è grande? Perchè spesso le proteine idrofobiche migrano su gel più basse rispetto alla loro taglia attesa. Tienlo presente quando tagli su gel. Un'altra cosa, forse sempre banale, è meglio non bollire i campioni prima di caricarli su gel SDS-page perchè i legami idrofobici si rompono e le proteine tendono a aggregare, a precitare e a restare nel pozzetto.
A me hanno detto che a priori le proteine idrofobiche possono essere determinate tagliando la banda da gel e facendo un maildi-tof come le proteine solubili, bè, la mia proteina è molto piccola e molto idrofobica, e non l'ho mai identificata con questa tecnica...
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SMO
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2010 : 20:33:05
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grazie mille dei consigli metionina :-)
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isolamento proteine idrofobiche
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