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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
 Inserito il - 06 aprile 2010 : 18:17:53
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Ciao a tuttiiii!! che bello essere tornataaaa!!!
Ragazzi approfitto per chiedervi una piccola spiegazione sulla strategia classica per ottenere topi KO ... in effetti non so se ho capito tutto bene perchč in aula ci sono stati degli attimi di confusione ... mi aiutate please?
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 ★°•. єѕтяєℓℓα .•°★ |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2010 : 19:15:31
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Bhé se cerchi su internet ne trovi a migliaia.
Sinteticamente
1) prendi la regione genomica che vuoi modificare, diciamo ad es da 5 kb prima a 5 kb dopo, e lo metti in un particolare plasmide.
2) Modifichi il gene per renderlo non funzionale, es elimini un esone importante, causi un frameshift o altro ed inserisci anche un gene per la resistenza ad un antibiotico.
3) inietti questo plasmide nelle cellule embrionali staminali e le selezioni per la resistenza all'antibiotico
4) fai crescere le cellule embrionali staminali ricombinanti e verifichi che il tuo DNA plasmidico si sia inserito correttamente per ricombinazione omologa. In genere si fa un Southern oppure una PCR particolare.
5) Il clone che ha una buona ricombinazione č cresciuto e poi iniettato in una blastocisti svuotata delle proprie cellule ES.
6) Queste blastocisti sono poi iniettate in una femmina pseudogravida che porterŕ a termine la gestazione.
7) I topi che nasceranno saranno chimerici, in parte formati dalle cellule ES wt, ed in parte da cellule ES transgeniche KO. Una volta accoppiati questi topi si origineranno figli wt e figli eterozigoti ko.
8) con tanta pazienza, generi un protocollo di genotipizzazione, ed incroci i topi per mantenere la linea.
Ovviamente sono indicazioni molto approssimative
Non so se ti servono dettagli piů specifici.
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Dionysos
Moderatore
Cittŕ: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2010 : 19:32:10
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A me interessa soprattutto il passaggio 3)
Quali sono le procedure di trasferimento genico piů 'feasible'
per le ESC? Transfezione? Trasduzione? Microiniezione? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontŕ e della libertŕ
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2010 : 20:20:59
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Il mio prof di TG ha parlato di trasfezione con vettori virali (HerpesV). Raga allora vi spiego l'esempio che ho io sul quaderno: mettiamo il caso di voler creare un KO per il gene 2; lui mette il gene per la resistenza all'AMP al 5', poi all'interno del gene 2 mette la resistenza alla NEO e poi al 3' la TK (tutto questo in un vettore virale)... viene tipo una cosa del genere:
AMP____2 NEO 2____ TK
ora in pratica, il gene 2 č bloccato giusto? perchč abbiamo inserito la NEO... vebbč poi il prof dice che a monte del gene NEO poniamo un promotore forte per attivare l'espressione , determinando una selezione negativa, in quanto la NEO č tossica per le cells umane. Questo allora vuol dire che le cells che esprimono la resistenza NON muoiono e quindi sono state trasfettate, mentre le cells che muoiono non hanno la resistenza e di conseguenza NON hanno integrato il vettore viarale... č corretto?
La presenza della TK permette di capire quali sono le cells trasfettate o meno, perchč somministrando il gancyclovir, con l'attivazione della TK, ci sarŕ la conversione di un composto tossico (essendo il gancyclovir un analogo della timina)...
Per cui questo frammento deve ricombinare con il frammento omologo non modificato 1____2____3
Se la ricombinazione omologa si č verificata correttamente otterrň
1____2NEO2____3 ovvero il cromosoma KO e le cells di interesse saranno resistenti alla NEO, non esprimeranno il gene 2 e saranno resistenti al gancyclovir perchč avranno perso la TK, č giusto ??? per favore ragazzi HELP!!
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Dionysos
Moderatore
Cittŕ: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2010 : 20:27:01
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Sě il concetto č giusto, ricordati solo che TK non serve semplicemente
a capire "quali sono le cells transfettate o meno" ma permette di
distinguere i cloni che hanno subito ricombinazione omologa (TK-,
e quindi resistenti a gancyclovir) da quelli che hanno subito
random insertion del plasmide (TK+, e quindi sensibili a gancyclovir) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontŕ e della libertŕ
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2010 : 21:53:16
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Ok grazie milleeeee!
P.S. ma il gene dell'AMP c'entra o no? |
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Dionysos
Moderatore
Cittŕ: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 00:47:35
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Quello serve per clonare il plasmide in E. Coli, direi.
Niente di diverso da ogni altro plasmide! |
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(F.W. Nietzsche)
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 15:27:49
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Ok, ora non č per affliggerti , ma volevo chiederti una sola cosa (giuro) sulla strategia Cre-Lox:
Allora si ricorre spesso a questa strategia perchč gli eventi di ricombinazione omologa sono molto rari?
Il frammento costruito č fatto piů o meno cosi:
1____| NEO 2 |____TK
LoxP LoxP
Di questa tecnica dico solo che la Cre-ricombinasi riconosce i siti Lox e determina ricombinazione tra questi favorendo l'excissione di tutto ciň che č compreso tra i 2 siti...
Perň in questo caso NEO nn viene eliminato? E se č eliminato le cells non sono piů resistenti! non ho capito questa cosa... |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2010 : 17:24:34
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La strategia Cre-Lox si usa per ben altri motivi...
1) č piů complessa della ricombinazione omologa, richiede infatti circa 2 ricobinazioni omologhe per inserire i siti loxP, piů due ricombinazioni Flox per togliere il gene della selezione. Quindi non serve per facilitare la ricombinazione omologa, bensě per fare cose piů complesse.
2) si puň usare per ottenere un topo KO tessuto specifico, es se l'enzima Cre č trascritto solo in determinati tessuti con promotori specifici
3) si puň utilizzare per ottenere un topo quasi KO per un determinato gene vitale. A volte basta anche un 10% di espressione di un gene per avere la vitalitŕ dell'animale.
4) si puň utilizzare per ottenere un topo transgenico attraverso la somministrazione di un farmaco che attiva la Cre e fa la ricombinazione
5) si puň utilizzare in casi piů specifici e complessi che non č il caso di mensionare.
Per l'altra domanda č sě, perň nel tuo caso potresti fare la ricombinazione direttamente in vivo, e quindi non fare la selezione, oppure in vitro e la selezione č semplice...
si prendono ad esempio 100 cloni cellulari e si mettono in pozzetti separati in triplice copia.
una piastra la sottoponi all'antibiotico, una piastra la cresci per fare lo screening, la terza piastra la usi per crescere le cellule.
Dovrebbe capitare che il clone X muore con l'antibiotico, ti dŕ un risultato positivo per lo screening, quindi usi la terza copia per fare l'esperimento.
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2010 : 22:11:24
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| Grazie Neuroscience... |
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badmanf85
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 12:17:45
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ANKE SE UN Pň IN RITARDO RIPORTO CIň CHE SO SUL KNOCK OUT DEI GENI DI TOPO.
OVVERO, INATTIVAZIONE O REPRESSIONE DI UN GENE
SUPPONIAMO DI AVERE IL NOSTRO GENE D'INTERESSE (DI CUI NN SAPPIAMO LA FUNZIONE) E LO TRASFORMIAMO CON IL GENE PER LA RESISTENZA ALLA NEOMICINA ALL'INTERNO DEL NOSTRO GENE (OTTENIAMO COSě LA RESISTENZA ALLA NEO E L'INATTIVAZIONE DEL GENE)ES: ---------GENE DI-(NEO)-NOSTRO INTERESSE----
INSERIAMO TRAMITE PLASMIDE, YAC, VETTORI IL NOSTRO GENE MODIFICATO IN CELL EMBRIONALI STAMINALI(PROVENIENTI DA UN TOPO NERO) E POTREMMO AVERE:
RICOMBINAZIONE OMOLOGA--> SOSTITUZIONE DEL GENE WILDE CON IL GENE OMOLOGO MODIFICATO(DI CUI SOPRA)
RICOMBINAZIONE NN OMOLOGA--> NN SOSTITUZIONE DEL GENE WILDE, MA INSERZIONE DEL GENE MODIFICATO IN UN QUALSIASI PUNTO DEL GENOMA
SUPPONIAMO DI OTTENERE UNA RICOMBINAZIONE OMOLOGA. LE CELLULE ES TRASFORMATE VENGONO IMPIANTATE IN UNA BLASTOCISTI DI UNA FEMMINA PSEUDO-GRAVIDA BIANCA E ASPETTIAMO LA PROGENIE!
LA G0 POTRŕ ESSERE CHIMERICA (TOPI BIANCHI CON MACCHIE NERE) O NORMALE. I TOPI CHIMERICI POTRANNO AVERE IL GENE MODIFICATO IN CELLULE GERMINALI O SOMATICHE, IN QUANTO LE CELL TRASFORMATE POSSONO ESSERSI DIFFERENZIATE NEI DUE TIPI DI CELLULE(QUINDI IN VARI TESSUTI).
PER CAPIRE CIň INCROCIAMO I TOPI CHIMERICI CON TOPI OMOZIGOTI BIANCHI. NELLA G1 TROVEREMO DEI TOPI COMPLETAMENTE NERI (ETEROZIGOTI WILDE/MODIFICATO) E SARANNO I TOPI FONDATORI!
PER CAPIRE PERň SE č AVVENUTA UNA RICOMBINAZIONE OMOLOGA O NO, SI PRENDE LO STESSO GENE PRECEDENTEMENTE MODIFICATO CON IL GENE PER LA NEO E SI AGGIUNGE UN GENE PER LA TIMIDINA KINASI DI UN HERPES VIRUS. SE LA RICOMBINAZIONE SARŕ OMOLOGA AVREMO SOLO IL GENE MODIFICATO, COME PRIMA, CHE HA INSERITO SOLO IL GENE PER LA NEO. SE LA RICOMBINAZIONE NN č OMOLOGA SI AVRŕ L'INSERIMENTO DEL TOTALE DNA E QUINDI ANKE LA PARTE DOVE C'č IL GENE PER LA TK...
SI PRENDONO LE CELL TRASFORMATE E LE SI FANO CRESCERE IN UN TERRENO CON LA NEOMICINA E IL GANCICLOVIR(NUCLEOSIDE SIMILE ALLA TIMIDINA), QUINDI IN CASO DI RICOMBINAZIONE NN OMOLOGA LE CELLULE RICONOSCERANNO IL GANCICLOVIR, GRAZIE ALLA TK, IL QUALE VERRŕ FOSFORILATO E PORTERŕ ALL'APOPTOSI CELLULARE, QUINDI LE CELL CHE HANNO SUBITO RICOMBINAZIONE OMOLOGA NN CRESCERANNO, MA MORIRANNO!
QUELLE INVECE CHE HANNO SUBITO LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA, AVENDO SOLO IL GENE RESISTENE ALLA NEO, NN RICONOSCERANNO IL GANCICLOVIR E DATO CHE HANNO IL GENE DELLA RESISTENZA PER LA NEO SOPRAVVIVERANNO!
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 15 aprile 2010 : 17:58:21
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Citazione:
PER CAPIRE CIň INCROCIAMO I TOPI CHIMERICI CON TOPI OMOZIGOTI BIANCHI. NELLA G1 TROVEREMO DEI TOPI COMPLETAMENTE NERI (ETEROZIGOTI WILDE/MODIFICATO) E SARANNO I TOPI FONDATORI!
Questo vorrŕ dire quindi che la mutazione si č stabilita anche nelle cells germinali, giusto? |
★°•. єѕтяєℓℓα .•°★ |
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badmanf85
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
Inserito il - 17 aprile 2010 : 14:32:55
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si! se si sono ottenuti i topi fonadatori, quindi quelli tutti neri, vuol dire che:
-si č avuta ricombinazione omologa nelle cellule ES, che poi sono state inserite in femmine pseuodo gravide
-la progenie ottenuta G0(chimere bianche e nere) incrociata con omozigoti white/white darŕ la G1
-se nella G1 abbiamo topi bianchi, il gene mutato si č inserito solo nelle cellule somatiche della G0
-se nella G1 abbiamo topi neri, il gene mutato si č inserito in cellule germinali!
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