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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
 Inserito il - 09 aprile 2010 : 14:48:49
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Ciao a tutti. Sto andando da un mesetto in laboratorio, sto facendo un bel pò di cose, volevo chiedervi un suggerimento: come faccio per caricare tutto il campione di dna nel pozzetto (con loading buffer e tutto) senza far uscire nemmeno una goccia? Ho provato ad andare lento, più veloce, il tutto con cautela ma qualche maledetta goccietta mi esce sempre, non che questo comprometta nulla... però è una questione di principio :D Qualche suggerimento da voi esperti è ben gradito!
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_ARY_
Nuovo Arrivato
Prov.: mi
Città: milano
81 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 14:54:30
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ciao,
credo che tu ti riferisca all'elettroforesi;allora prima di iniziare a colare i gel assicurati che i vetri sian ben incastrati,poi poni il puntale della pipetta a un estremo (destra o sinistra come preferisci)e inizia a far scendere il tutto con una velocità costante magari se la mano vibra un po'poggia il puntale tra i vetri tranquillamente oppure io di solito uso l'indice della mano che nn impugna la pipetta sotto il puntale in modo da evitare che si muova a muzzo.
per caricare i campioni stesso trucchetto tieni fermo il puntale con l'altra mano..
mi sembra tutto .
spero di esser riuscita a spiegarmi^^
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 15:00:08
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Sì parlo di elettroforesi ovviamente  Guarda io ho la camera elettroforetica orizzontale quindi mi metto sopra al pozzetto con la punta dritta e mi appoggio sul bancone col gomito del braccio dove impugno la pipetta, questo perchè se sto in sospensione tremo tutto eheh. Il mio problema non è più il fatto di non centrare il pozzetto bene ma quello di caricarci tutto senza perdere nulla, ad esempio un campione del volume di 12 microlitri quando lo carico alla fine un pò mi esce... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 15:26:47
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| In generale se vai più lento è meglio perchè dai il tempo al loading buffer di scendere nel pozzetto (tirandosi dietro il DNA) |
Sei un nuovo arrivato?
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 15:49:43
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guarda, credo che sia più o meno impossibile caricare perfettamente TUTTI i pozzetti, anche perchè l'LB dell'elettroforesi su DNA tende a diffondere un sacco!! comunque capisco perfettamente la tua "questione di principio", e infatti anch'io mi sono dannata per lo stesso tuo motivo... ecco il mio sistema (devo dire che funziona abbastanza bene, sono molto fiera di questo!!! 
raccolgo il campione con il puntale, il 99,9% delle volte mi rimane un po' d'aria nella punta, quindi prima di immergere nel buffer premo fino a che il mio volume non arriva proprio all'estremità del puntale (questo per evitare che quando carico mi esca la prima bolla, che poi salendo verso la superficie si porta appresso il blu).
la seconda bolla è inevitabile (dopo un consulto con altri biologi e tecnici, siamo giunti a questo altro dogma della biologia molecolare..), perciò in genere io carico il più vicino possibile al fondo del pozzetto, quando arrivo al primo stop, sollevo leggermente il puntale, in modo che resti nel pozzetto, ma non sia immerso nel campione, a quel punto scarico fino al secondo stop, magari muovendo leggermente il puntale e sollevandolo piano fuori dal pozzetto, in modo che la bolla non si porti dietro anche il campione...
comunque come dicevi giustamente tu, non è che se esce un po' di campione ti si rovina il risultato, ovviamente più preciso sei e meglio è, ma non impazzire... e soprattutto, stai attento quando appoggi il gomito sul bancone!!!! se carichi DNA presumibilmente ti trovi in un ambiente dove si maneggia il bromuro d'etidio!!!! (consigli da biologa apprensiva...)  |
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Arf
Nuovo Arrivato
31 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 15:52:32
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| Io generalmente mi muovo da una parte all'altra del pozzetto mentre "scarico" il campione per dargli modo di stratificare meglio( una mia fobia?) e faccio fare il secondo scatto alla pipetta mentreestraggo il puntale (faccio la bollicina d'aria al pelo del buffer), il tutto lentamente, prova magari può esserti utile. |
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 17:49:50
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Citazione:
Messaggio inserito da cami
guarda, credo che sia più o meno impossibile caricare perfettamente TUTTI i pozzetti, anche perchè l'LB dell'elettroforesi su DNA tende a diffondere un sacco!! comunque capisco perfettamente la tua "questione di principio", e infatti anch'io mi sono dannata per lo stesso tuo motivo... ecco il mio sistema (devo dire che funziona abbastanza bene, sono molto fiera di questo!!!
raccolgo il campione con il puntale, il 99,9% delle volte mi rimane un po' d'aria nella punta, quindi prima di immergere nel buffer premo fino a che il mio volume non arriva proprio all'estremità del puntale (questo per evitare che quando carico mi esca la prima bolla, che poi salendo verso la superficie si porta appresso il blu).
la seconda bolla è inevitabile (dopo un consulto con altri biologi e tecnici, siamo giunti a questo altro dogma della biologia molecolare..), perciò in genere io carico il più vicino possibile al fondo del pozzetto, quando arrivo al primo stop, sollevo leggermente il puntale, in modo che resti nel pozzetto, ma non sia immerso nel campione, a quel punto scarico fino al secondo stop, magari muovendo leggermente il puntale e sollevandolo piano fuori dal pozzetto, in modo che la bolla non si porti dietro anche il campione...
comunque come dicevi giustamente tu, non è che se esce un po' di campione ti si rovina il risultato, ovviamente più preciso sei e meglio è, ma non impazzire... e soprattutto, stai attento quando appoggi il gomito sul bancone!!!! se carichi DNA presumibilmente ti trovi in un ambiente dove si maneggia il bromuro d'etidio!!!! (consigli da biologa apprensiva...)
Quello di partire col campione nel puntale tenendo premuto in modo da non avere aria in mezzo lo faccio anche io Proverò a salire piano piano dal pozzetto quando carico, comunque alla fine dipende dal volume che ci si vuole caricare i 5 microlitri di marcatori ad esempio non mi escono proprio perchè sono pochi, cercherò di perfezionarmi grazie dei consigli. Per quanto riguarda il bancone, solitamente tracce di EtBr non le ho viste, tra l'altro i gel li preparo spesso io e non sporco proprio nulla, se non mi appoggio per me è la fine! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 17:58:07
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Se il tuo campione tende a diffondere troppo, significa che
contiene ancora etanolo perchè non si è asciugato bene durante
la purificazione! |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Morfeo
Nuovo Arrivato
Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 20:12:33
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Se il tuo campione tende a diffondere troppo, significa che
contiene ancora etanolo perchè non si è asciugato bene durante
la purificazione!
Guarda la maggior parte delle volte ho caricato DNA plasmidico, un paio di volte il genomico dove per purificarlo era stato usato anche etanolo. Non dipende da questo, è che quando inizia a riempirsi il pozzetto e mi ritrovo il puntale immerso la fine del campione mi esce fuori dal pozzetto, ho provato a starci sempre attento però bo un pò esce sempre. |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 09 aprile 2010 : 21:31:30
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| Non caricare tenendo il puntale verticale, inclina la pipetta di circa 45 gradi, vedrai che è tutta un'altra storia. E ovviamente vai piano per dare il tempo al buffer di stratificare. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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Mafalda8
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2019 : 13:34:07
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| ciao a tutti,io invece sono alle prime armi,sono le prime volte che carico i pozzetti,la mia difficolta' e' nel vedere bene i pozzetti nella camera col buffer,per cui disastro,qualche dritta?please |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Mafalda8
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2020 : 11:49:46
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grazieeeee
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Discussione |
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caricare per bene nei pozzetti del gel di agarosio
Didattica e Relazioni
