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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 20 aprile 2010 : 00:55:29
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Ciao!
Vi espongo subito il problema.
Sto effettuando dei western blotting su degli omogenati di proteine di vari organi e tutto sta uscendo molto bene.
Ho solo un problema con una proteina di 72 kDa, il cui filtro risulta sempre sporco, proteina poco visibile e sembra comparire anche qualche altra bandina (forse un precursore o qualche altro prodotto).
Premetto che non ci sono problemi nei vari passaggi della tecnica, poichè lo stesso filtro, con gli stessi procedimenti ma trattato con un anticorpo diverso, mostra ottimi risultati (banda nitida, filtro pulitissimo, ecc..).
Escludo anche problemi relativi alla dimensione della proteina. Poichè ho seguito proteine di dimensioni sia maggiori che minori e vengono viste senza problemi.
Il problema potrebbe essere l'anticorpo, anche se relativo, poichè usando lo stesso anticorpo sull'omogenato proveniente da un diverso tessuto, il tutto esce bene (ed esce una sola banda!!).
Ho provato ad usare varie diluizioni di primario (1: 2000, 1: 2500, 1:3000), ma ovviamente con la diluizione più bassa vedo bene la proteina ma il filtro è sporchissimo (e al chemidoc non si vede niente), a diluizioni maggiori filtro leggermente più pulito, ma proteina poco visibile.
La diluizione del secondario è stata invece di 1: 10000.
Il trattamento col primario è fatto in latte 1%, mentre il secondario 5%.
Chiaramente è proprio la proteina che è espressa poco e in forme diverse, ma cosa potrei fare per ottimizzare la tecnica e riuscire ad osservarla meglio?
Qualche consiglio?
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
 Inserito il - 20 aprile 2010 : 10:13:19
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il fatto che la stessa proteina esca bene in alcuni tessuti e in altri no non mi stupisce affatto... forse potresti provare a mantenere la concentrazione del primario invariata e giocare un po' sul secondario (a proposito, ma cos'è?). potresti concentrare il secondario, e se la lastra risulta molto sporca, aumentare la concentrazione del latte (io ho avuto buoni risultati col latte al 7,5% e il secondario più concentrato..). un'alternativa è quella di usare la BSA al posto del latte, dovrebbe darti meno aspecifico..
tu usi PBS tween per i lavaggi e per preparare il latte? molti usano TBS tween e pare che abbiano risultati migliori, io non lo so perchè l'ho fatto solo un paio di volte e non è statisticamente significativo ( ), però è un'opzione...
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2010 : 14:19:18
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Innanzitutto, grazie per la risposta! Si uso il PBS-tween sia per i lavaggi che per il latte.
Il secondario che uso è un anti-rabbit. Quindi usando latte più concentrato potrei ridurre la sporcizia. Ma lo useresti più concentrato solo per gli anticorpi secondari, o anche durante il blocking?
E il primario invece lo lasceresti sempre all'1%? |
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2010 : 14:45:26
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figurati!  le problematiche sui western blot mi toccano sempre da vicino... 
per il blocking io faccio sempre il latte al 5%, al massimo lo lascio per più tempo, invece che per un'ora, però credo che in realtà cambi ben poco.. se aumenti la concentrazione dovresti diminuire i tempi, almeno così mi hanno sempre detto, per esempio da me si fa anche al 10%, ma per mezz'ora..
per preparare il primario normalmente io faccio il latte sempre al 5%, l'ho usato a concentrazioni minori solo in casi rarissimi e solo perchè mi è stato consigliato il protocollo dalla ragazza che me l'ha prestato e quindi l'aveva già usato.. visto che tu hai il filtro molto sporco forse aumentare un po' la concentrazione del latte nel primario non sarebbe male, però è anche vero che se devi fare molte prove, allora mi sa che ti conviene provare prima a cambiare le condizioni del secondario, più che altro per una questione di costi..
un'altra cosa che potresti fare, comunque, è tagliare il filtro, se ne hai la possibilità, in molti casi questo mi ha risolto molti molti moooolti problemi..
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2010 : 22:54:56
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Il filtro lo taglio sempre, anche perchè seguo contemporaneamente più proteine.
Ed è anche per questo che ti ho detto che il filtro esce pulitissimo con gli altri anticorpi e che solo verso questa proteina ci sono problemi!
Vedrò di fare delle prove allora!
Grazie ancora per i consigli! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2010 : 00:04:30
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Prima prova fatta, ma è fallita!
Proviamo ad intervenire sul primario dunque! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2010 : 00:46:02
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| se hai dubbi che sia il secondario a legarsi aspecificamente puoi sempre fare una incubazione con il solo secondario e vedere cosa esce. Sei sicuro che in efetti nn siano isoforme della tua proteina quelle che vedi? |
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jonh
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
Inserito il - 28 aprile 2010 : 00:46:25
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Potresti provare a caricare meno proteina,
oppure ad eseguire il bloking ON;
ancora potresti fare il bloot ON, a basso voltaggio in camera fredda. 72kda proteina abbastanza pesante e possibile ke le bande ke vedi siano dovute ad una degradazione; in questo caso dovresti vedere un piccolo smear. Perkè nn ci metti una scansione della tua lastra tanto nn sappiamo neanke ke proteina è???
Ancora ke ECL usi? uno molto sensibile? potresti cambiarlo con uno meno più economico.
Ancora se il tuo 2 e fatto in coniglio potresti preincubare il filtro con un siero di coniglio
Ancora potresti aumentare la % di tween. Insomma le possibilità non mancano datti da fare |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2010 : 00:26:54
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Prima di tutto grazie ancora per le risposte e i consigli!
Oggi ho provato ad usare latte 10% e primario in 5%. Un leggero miglioramento c'è stato, ma resta sempre sporco.
Il bello è che ho provato a vedere anche l'actina (che è sempre uscita bene) nelle stesse condizioni e il filtro in quel caso è uscito di uno splendore unico. Neanche sovra-esponendo sono riuscito a vedere lo sporco.
Anzi, addirittura l'actina compariva divisa in 2 bandine vicinissime, forse proprio il frutto dell'eccessiva saturazione del latte.
Rispondo ora ai vostri consigli!
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
se hai dubbi che sia il secondario a legarsi aspecificamente puoi sempre fare una incubazione con il solo secondario e vedere cosa esce. Sei sicuro che in efetti nn siano isoforme della tua proteina quelle che vedi?
Non penso che il secondario si leghi aspecificamente poichè quando lo uso per altre proteine di dimesioni simili (e quindi tagliando la stessa porzione di filtro) il tutto esce pulitissimo.
Purtroppo poi le leggerissime bandine che si vedono sono solo il minor problema.
Il principale è che è proprio il filtro sporco.
Citazione:
Potresti provare a caricare meno proteina,
Carico una concentrazione di 10 microgrammi/microlitro. E già così è dura vedere la banda di questa proteina...Forse è proprio che in quell'organo viene espressa poco...
Citazione:
oppure ad eseguire il bloking ON
Perdona l'ignoranza, cos'è?
Citazione:
ancora potresti fare il bloot ON, a basso voltaggio in camera fredda. 72kda proteina abbastanza pesante e possibile ke le bande ke vedi siano dovute ad una degradazione; in questo caso dovresti vedere un piccolo smear.
Si questo è vero e potrebbe poi anche portare a far sporcare tutto il filtro. Certo sarebbe da capire però perchè invece la stessa proteina nelle medesime condizioni in un altro organo esce benissimo al western. Lì allora non si degrada (dando per giusta questa ipotesi).
E inoltre altre proteine anche più pesanti portano a filtri puliti.
Citazione:
Perkè nn ci metti una scansione della tua lastra tanto nn sappiamo neanke ke proteina è???
La proteina è PGC1-beta, un coattivatore trascrizionale.
Quanto alla scansione cercherò di recuperarla, anche se non sarà facile.
Citazione:
Ancora ke ECL usi? uno molto sensibile? potresti cambiarlo con uno meno più economico.
Il nome non lo ricordo, ma posso ovviamente vedere.
Citazione:
Ancora se il tuo 2 e fatto in coniglio potresti preincubare il filtro con un siero di coniglio
Magari poter fare questo esperimento!
Citazione:
Ancora potresti aumentare la % di tween.
Attualmente uso PBS 1X -tween 0.1%. A quanto potrei arrivare? Domani penso di prepararlo allo 0.5%. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 29 aprile 2010 : 01:13:30
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Citazione:
>oppure ad eseguire il bloking ON
Perdona l'ignoranza, cos'è?
Il bloccaggio con BSA o latte per tutta la notte (ON = overnight)
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Hai provato il TBS-Tween invece del PBS-Tween? |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2010 : 23:47:05
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Anche se in ritardo, vi aggiorno!
Innanzitutto grazie anche a chick80 per le spiegazioni (ma cos'è il TBS? Mai provato!).
Dopo varie prove, ho tentato questa: primario in 5%, secondario in 10% e soprattutto il PBS-Tween 0,5%!!!
E finalmente ho ottenuto un filtro pulito con un'unica banda ben visibile.
L'unico problema ora è che nelle stesse condizioni ora scompare completamente l'actina, totalmente "divorata" dal latte e tween, ma penso basterà aumentare la concentrazione dell'anticorpo per visualizzarla nuovamente.
Non so ancora come ringraziarvi per le dritte! Mi fa piacere di essere riuscito alla fine a rendere visibile una proteina che sembrava invisibile! |
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angemore
Nuovo Arrivato
82 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2010 : 13:44:59
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Citazione:
L'unico problema ora è che nelle stesse condizioni ora scompare completamente l'actina, totalmente "divorata" dal latte e tween, ma penso basterà aumentare la concentrazione dell'anticorpo per visualizzarla nuovamente
Puoi semplicemente tagliare il filtro ed incubare con le stesse conc. di anticorpo e di milk come hai sempre fatto, tra il peso molecolare della tua proteina e quello dell'actina c'è abbastanza differenza mi pare per poterlo fare
Citazione:
Innanzitutto grazie anche a chick80 per le spiegazioni (ma cos'è il TBS? Mai provato!)
E' una soluzione salina molto simile al PBS ma la concentrazione dei sali in questo caso è leggermente più elevata per cui ti rende più stringenti le condizioni di lavaggio e ti aiuta quindi ad eliminare un pò di background.
Se ti può servire la ricetta per il 10x è questa:
To make 10 L of 10X TBS buffer, add the following together: (note: 10L with last a very long time!)
* 876.6 g NaCl (FW 58.44),
* 121.1 g Tris,
* 40 ml HCl
...di solito 1 litro è più che sufficiente per cui ti consiglio di riadattare i calcoli
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2010 : 15:30:55
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Ottimo, grazie!
Può sempre servire in effetti! |
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Consigli Western Blotting
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