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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 02 maggio 2010 : 16:55:44
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Salve ragazzi, avrei bisogno del vostro aiuto per sapere se, da quel po' che ho letto, ho capito bene!
Sarò + chiara
se voi voleste capire se il promotore di un vostro gene è sottoposto o meno ad acetilazione, come fareste?
Io ho pensato: faccio la ChIP (chromatin immunoprecipitation) utilizzando un anticorpo che riconosce un istone acetilato (ce ne sono diversi in commercio: per diversi residui di diversi istoni) e con primer specifici amplifico la regione intorno al miopromotore di interesse.
Oppure, faccio una ChIP con anticorpo anti-lisina acetilata, ma in tal caso potrei portare giù non solo istoni, ma anche proteine legate al DNA acetilate (fattori di trascriz, istoni deacetilasi o acetilasi) e quindi non posso essere certa che gli istoni del mio promotere sono acetil!
Vi torna tutto ciò? Secondo voi è tecnicamente possibile? Usereste qualche altro approccio?
Questa è solo la prima di una serie di domande al riguardo 
Geazie fin da ora! 
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2010 : 17:50:44
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Così a lume di naso il primo procedimento mi sembra corretto. Se non erro cromatina e istoni/fattori di trascrz. ecc vengono crosslinkati con paraformaldeide, così ti porti giù complesso proteico/DNA senza perderti nulla durante l'immunoprecipitazione.
il secondo procedimento non so, non mi pare di averlo mai visto applicato nella immunoprecipitazione ma potrei benissimo sbagliare perchè non ne ho mai fatte. Ad ogni modo penso che potresti limitare precipitazioni "aspecifiche" frazionando il lisato cellulare e lavorando sui nuclei e quindi sulla cromatina che ne ricavi. Però penso che tra i due sia + conveniente il primo procedimento |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2010 : 18:01:36
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Grazie Spermann,
anche io la penso come te: conviene il primo a naso!
Ma come scelgo l'anticorpo da usare? esistono diversi anticorpi per istoni acetilati (legano diversi siti di acetilaz degli istoni e diversi istoni: scegliendo uno di questi anticorpi faccio una selezione a monte! Che è sbagliato). |
Ascoltami con gli occhi... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2010 : 18:26:25
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Ehmm, Spemann, non SpeRmann, che sembra un'altra cosa 
Sinceramente per l'anticorpo non so cosa dirti con esattezza. Se non ricordo male gli istoni + interessati da questo tipo di modificazione sono gli H3 e H4 quindi potresti pensare ad un anticorpo contro l'uno o contro l'altro. Però non so se sia possibile che un istone piuttosto che un altro venga preferenzialmente acetilato (o de-acetilato) a livello di un dato promotore. Prova a guardare in letteratura o a chiedere a qualcuno esperto del campo. Al limite non hai la possibilità di usarne più di uno, così da testarne anche l'efficienza? |
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