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Smichel
Nuovo Arrivato
36 Messaggi |
 Inserito il - 09 maggio 2010 : 10:16:36
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salve,
qualcuno mi sa spiegare come si riescono ad eliminare problemi di cross-reazioni indesiderate mediante adsorbimento con l'antigene negli anticorpi policlonali per aumentarne la specificità di legame?
Mi sapete anche spiegare come si fa ad aumentare la specificità (sempre di policlonali) con cromatografia di affinità usando l'antigene purificato?
Grazie a tutti.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 12:09:37
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Senti, in genere si usa (per esempio per le reazioni di immunoistochimica) pre-incubare l'anticorpo con la BSA al 3%(albumina del siero bovino) o con altre proteine (mi viene in mente per esempio l'egg extract quando si lavora con Xenopus). Spesso anzichè incubare l'anticorpo si usa equilibrare il tuo campione con le dette soluzioni. Questo ha l'effetto di "rimuovere" gli anticorpi che si legano aspecificamente (che si legano alle proteine che tu hai messo)lasciando disponibili quelli che legano il tuo antigene in maniera specifica.
Per quanto riguarda la cromatografia di affinità, immagina una colonna con una matrice sulla quale sono legati i tuoi antigeni estremamente purificati. Ci fai passare il tuo anticorpo policlonale e solo le Ig che legano strettamente e quindi specificamente il tuo antigene rimarranno legati alla matrice, gli altri vengono eluiti al primo lavaggio. Alla fine i tuoi anticorpi "puliti" ed estremamente specifici vengono eluiti aggiungendo una soluzione generalmente a pH + basso in maniera da interferire con il legame antigene-anticorpo ed eluire quindi i tuoi anticorpi.
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Smichel
Nuovo Arrivato
36 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 14:29:58
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perfetto. grazie mille.
ho solo una domanda.
ma se metto la BSA sul mio campione e poi ci metto gli anticorpi che si legheranno aspecificatamente a questa poi non otterrò un segnale aspecifico di legame in zone del campione dove si è depositata la BSA, ma dove non c'è l'antigene specifico?
Invece quando metto la BSA negli anticorpi, poi come separo quelli che si sono legati alla BSA da quelli rimasti liberi? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 15:02:54
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Tieni conto che il campione viene lavato diverse volte, prima e anche dopo l'aggiunta dell'anticorpo secondario. Quindi in teoria tutte le schifezze legate aspecificamente vengono lavate via dai lavaggi.
Per quanto riguarda la seconda domanda, gli anticorpi non vengono separati, ma messi così come sono.
In ultima analisi, se fai una immunoistochimica il fondo te lo ritrovi spesso, almeno un pò. Con questi stratagemmi lo riduci un pò, ma almeno per esperienza personale ti posso dire che un pò di rumore di fondo ti ci rimane sempre.Puoi ulteriormente "pulire" l'immagine se usi un apotome montato sul tuo microscopio o ancora meglio un confocale.
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Smichel
Nuovo Arrivato
36 Messaggi |
Inserito il - 09 maggio 2010 : 15:17:14
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ok ora ho capito tutto.
grazie mille. |
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Eliminazione cross-reazioni anticorpi policlonali
Didattica e Relazioni
