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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 11 settembre 2010 : 11:46:03
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Salve ragazzi!
Ho bisogno del vostro aiuto su una tecnica nienete semplice... in cui per di + sono stata iniziata da pochiiiiissimo! 
Faccio (in realtà ci provo..) delle letture al FACS di fibroblasti primari di topo (mef) trasgenico per una proteina fusa a GFP. Dò uno stimolo in seguito al quale la gfp è degradata (è pubblicato), quindi devo vedere una diminuz della fluorescenza.
Allora! intanto, non so perchè, a differenza di quanto riportato in letteratura (), io vedo 2 picchi in FL1 (senza stimolo) anzichè uno solo...
Stranezza delle mie cell?
Poi, dando lo stimolo, i 2 picchi si avvicinano... quindi uno diminuisce di fluorescenza, l'altro aumenta (?).
Capirete che nn so dove mettere mano per fare l'analisi: in letteratura mi dicono di guardare la geo mean (che ho capito qual è nella statistica, ma cosa rappresenta?), ma su quale dei 2 picchi?
Ho fatto un esperimento di settaggio in time course in cui ho fatto l'analisi prendendo entrambi i picchi. A parte la stranezza dei 2 picchi... i valori della geo mean si abbassano in seguito a stimolo... quindi potrebbe andar bene il modo in cui tratto i campioni e li acquisisco.
Ma qui il mistero si infittisce  : ho rifatto lo stesso esperimento, ma quello vero, includendo i campioni di mio interesse (quindi trasgenici per la prot fusa a gfp e per la proteina di mio interesse) oltre a portarmi dietro le cell trasgeniche solo per la proteina di fusione. Ebbene... nel campione di "Ctr", sia con stimolo che non, vengono picchi diversi rispetto all'esperim di settaggio!!!
L'ho rifatto una terza volta, e picchi ancora leggermente diversi anche sul ctr (e quindi valori diversi in analisi!).
E nota bene... quando dico diversi intendo ke nn è rispettato nemmeno il trend: geo mean non diminuisce + in seguito a stimolo! 
Spero di essere stata chiara... ogni suggerimento è bene accetto!
P.S. qualcuno sa darmi qualke link affidabile dove capire come settare i parametri "in modo giusto" prima di acquisire: come deve essere distribuita la popolazione, ad es., etc.
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 11 settembre 2010 : 12:15:49
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Aggiunta  un'info che non so se può essere utile: ho provato a trattare uno dei miei campioni di ctr (quindi con la GFP) non trattati con IP e ho letto in fl1 (su consiglio di una pers + esperta di me) e come per magia il 2picco spariva e restava il primo! che può voler dire?!?!?
ha un senso?
PS io analizzo cell vive, non fissate, solo le stacco con tripsina e lavo in pbs e risospendo in pbs. |
Ascoltami con gli occhi... |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2010 : 12:17:14
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scusate... nel secondo intervento ho psticciato con l'italiano e nn si capisce cosa ho fatto: ho preso uno dei camp di ctr e l'ho trattato con lo IP.... ed è successo quanto vi ho spiegato sopra.
Scusate. |
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GFP.. e nn solo.. al facs
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