saggio della luciferasi

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biochem85
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2 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2010 : 17:58:03

Salve a tutti, dovrei fare un saggio della luciferasi per valutare se la mia proteina di interesse X ha un qualche effetto sull'espressione di un gene Y ..� la prima volta che faccio questo esperimento...in pratica vado a co-trasfettare il costrutto cn la regione del promotore di Y fusa al gene della luciferasi pi� il costrutto che condifica per la mia proteina X da saggiare in quantit� crescenti...in pi� dovrei co-trasfettare a parte un altro costrutto cn il gene della luciferasi sotto il controllo di un altro promote sul quale la mia proteina nn dovrebbe avere alcun effetto...dico bene?quanto devo trasfettare? 10 gamma e 10 gamma?
in pi� vorrei valutare la bioluminescenza direttamente nella piastra..senza raccogliere..quindi dovrei co-trasfettare anche la luciferina ed aggiungere ATP...qualcuno ha un protocollo che potrebbe fare al caso mio?grazie in anticipo a chiunque mi sar� d'aiuto

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2010 : 00:45:58

Ciao...

sono un esperto di questo tipo di esperimento facendone pratucamente tutte le settimane...

nel tuo caso dovresti fare una tripla co-trasfezione delle tue cellule con questi vettori

vettore 1) vettore d'espressione. ossia il vettore che esprime la tua proteina di interesse.

vettore 2) vettore reporter. Il vettore che ha il gene della luciferasi sotto il controllo della tua sequenza promotrice...in genere si usano i vettori della famiglia pGL3 o pi� nuovo pGL4...

vettore 3) vettore normalizzatore. nel senso che servir� a normalizzare i tuoi risultati. essendo una trasfezione transiente non tutte le tue cellule saranno trasfettate e devi quindi normalizzare per efficienza di trasfezione. In genere si usa un vettore che porta una luciferasi differente da quella del gene reporter. per esempio in genere il reporter ha il gene della luciferasi di lucciola (firefly) e il normalizzatore quello di una medusa (renilla).

la quantit� di DNA dipende dal formato dell'exp e dal reagente trasfettante. se il reagente � buono, e ce ne sono di numerosi tipo oggigiorno in genere questi si fanno facendo crescere e trasfettando le cellule nelle piastre da 24-12 oppure 6 pozzetti...la quantit� sale progressivamente 500ng, 1 ug, 2 ug rispettivamente...distrubuendo i vettori con il maggiore per il reporter (250-300ng) poi quello di espressione (100-250ng) e il normalizzatore (50-100ng)...queste quantit� sono ok per la pistra da 24 wells...se sali come dimensioni del pozzetto aumenti di conseguenza anche il DNA