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Paul
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 23 settembre 2010 : 10:23:40
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Buongiorno a tutti,
premetto che tutt'altro che un esperto in materia, essendo un ricercatore di estrazione ingegneristica.
Sto studiando la cinetica di reazione di due enzimi di restrizione, il BamHI e il DpnII, che operano un taglio del DNA in una precisa sequenza di basi. Io devo misurare la concentrazione di DNA non reagito (S, substrato) e tagliato (P, prodotto) in diversi istanti di tempo, in modo da ricavare le costanti cinetiche Km e kcat, assumendo l'ipotesi che il meccanismo sia quello di Michaelis Menten (ipotesi già verificata in letteratura).
Per misurare la concentrazione si è scelto di usare l'elettroforesi su gel di poliacrilammide: in ogni pozzetto si mette la soluzione in cui la reazione è bloccata (con inibitore dell'enzima) a diversi tempi, e quello che si ottiene ad ogni tempo sono due bande a divrse altezze: una più alta riferita a S e una più bassa riferita a P. Per conoscere la concentrazione delle bande dopo la corsa, si immerge il gel in etidiobromuro per un certo tempo, e poi con uno strumento di misura l'intensità di fluorescenza delle bande. Per ricavare le concentrazioni io ho brutalmente ipotizzato una proporzionalità diretta tra intensità e concentrazione della banda, sia per S che per P. I valori di intensità delle bande li normalizzo a quella della banda di S non reagito (DNA non messo con l'enzima e fatto correre nel gel).
Il problema è che in molti casi, i valori di intensità non sono logici, ossia certe volte S cresce anzichè diminuire con t, e viceversa accade per P. Inoltre, pur ottenendo degli andamenti ragionevoli,constato che sono qualitativamente diversi tra loro e non so quale ritenere affidabile e quale scartare. E questo mi accade per entrambi gli enzimi. Per ora le prove su ciascun enzima non sono tante, ma non so se ho sbagliato e in cosa potrei aver sbagliato.
Dopo diverse prove, ho il dubbio che l'analisi delle bande per avere le concentrazioni sia inadatta, mentre si presti per fare delle valutazioni qualitative. MI sbaglio?
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2010 : 11:56:56
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Messaggio inserito da Paul
Per ricavare le concentrazioni io ho brutalmente ipotizzato una proporzionalità diretta tra intensità e concentrazione della banda, sia per S che per P. I valori di intensità delle bande li normalizzo a quella della banda di S non reagito (DNA non messo con l'enzima e fatto correre nel gel).
l'etidio si intercala tra le basi proporzionalmente alla grandezza dei frammenti. Questo significa che un frammento più grande, più lungo in bp, avrà una intensità di fluorescenza maggiore di un frammento più piccolo a parità di concentrazione o anche a concentrazioni lievemente inferiori (dipende poi logicamente dalla grandezza del frammento), semplicemente perchè il primo ha più "spazio disponibile" per l'etidio. credo che tu debba considerare anche questo nella tua analisi.
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Paul
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2010 : 12:30:50
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Grazie mille Iside!
E' una aspetto che non avevo considerato...
Essendo il sito di taglio posto appositamente a metà del frammento di DNA, posso normalizzare i valori delle bande di P alla META' dell'intensità della banda di S non digerito (ossia DNA senza enzima, corrispondente a tutto l'etidio che il frammento può intercalare)?
Grazie ancora per il prezioso suggerimento!
PS: per quanto riguarda un giudizio della tecnica rispetto al fine quantitativo dell'indagine, pensi che queste analisi siano appropriate e sufficientemente accurate per determinare delle concentrazioni? Hai già sentito dell'uso per stimare delle concentrazioni? (magari è una domanda stupida, perdona la mia ignoranza, sono un neofita della materia) |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2010 : 14:44:16
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Citazione:
Messaggio inserito da Paul
Grazie mille Iside!
E' una aspetto che non avevo considerato...
Essendo il sito di taglio posto appositamente a metà del frammento di DNA, posso normalizzare i valori delle bande di P alla META' dell'intensità della banda di S non digerito (ossia DNA senza enzima, corrispondente a tutto l'etidio che il frammento può intercalare)?
entrambi gli enzimi hanno un sito di taglio al centro del frammento? credo cmq che possa andare per una stima di massima ma non per un'analisi accurata.
Citazione:
Messaggio inserito da Paul
PS: per quanto riguarda un giudizio della tecnica rispetto al fine quantitativo dell'indagine, pensi che queste analisi siano appropriate e sufficientemente accurate per determinare delle concentrazioni? Hai già sentito dell'uso per stimare delle concentrazioni? (magari è una domanda stupida, perdona la mia ignoranza, sono un neofita della materia)
mi spiace paul, non so risponderti  Posso al limite dirti cosa ne penso io, ma prendi il mio parere con le pinze. non ho mai sentito di un'indagine fatta in modo simile, considera ch eio mi occupo prevalentemente di biologia cellulare quindi non sono esperta del settore. credo però che il metodo sia non troppo accurato...comunque prova a dare uno sguardo a questo paper: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bi0601712
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Paul
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 23 settembre 2010 : 16:31:12
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Grazie per le risposte,
la sequenza di taglio è sostanzialemnte la stessa per gli enzimi, ed è stata posta a metà del frammento utilizzato perchè ciò consente in altre analisi una più facile identificazione del tagliato.
Purtroppo ho trovato riscontri di questo metodo analitico solo in vecchi articoli (tipo degli anni 80). Ho l'impressione di utilizzare una tecnica ormai desueta.
Proverò a cercare qualcosa riguardo l'analisi della fluorescenza da etidio bromuro con il DNA. Credo che l'unica via per migliorare i risultati sia ottimizzare quanto più possibile il trattamento dati.
A presto e grazie ancora! |
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Cinetica enzimatica con elettroforesi su gel
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