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 FACS: Ab primario ON?
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domi84
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Smile3D
Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2010 : 11:33:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno ha mai fatto un Ab primario OverNight su delle cellule, a 4°C?
Funziona?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2010 : 11:42:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Funzionare funziona, ma se è un surface staining Ab
oltre la mezz'ora di incubazione inizierà a legarsi
dappertutto. Hai un controllo negativo appropriato?
(i.e. cellule negative per l'antigene testato)

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 29 settembre 2010 : 12:15:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

Funzionare funziona, ma se è un surface staining Ab
oltre la mezz'ora di incubazione inizierà a legarsi
dappertutto. Hai un controllo negativo appropriato?
(i.e. cellule negative per l'antigene testato)


non è un surface staining, deve entrare all'interno della membrana.
Sto solo settando un protocollo, quindi ho:
cell non trasfettate, senza Ab secondario
cell non trasfettate con Ab primario e secondario
cell trasfettate con Ab primario e secondario
devo solo capire se questo Ab che abbiamo fatto funziona per FACS.
In teoria dovrei avere segnale 0 nel primo controllo
segnale 1 nel secondo (dovrebbe riconoscere l'endogeno)
segnale 100 nel trasfettato.
Quindi dici che può funzionare?! a 4°C ovviamente l'incubazione?
Grazie!

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 04 ottobre 2010 : 23:54:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io faccio marcature intracellulari per fosforilazioni e ti direi
che allungare l'incubazione a un'ora o più è sicuramente una buona
idea. Overnight mi sembra francamente un po' tanto, ma non ho mai
provato. Il rischio è sempre quello: binding aspecifico. Se hai un
controllo negativo interno (i.e. il tuo antigene è espresso solo da
alcune cellule in coltura, non tutte) o esterno (i.e. un tipo cellulare
che non esprime l'antigene, incubato con gli Ab allo stesso modo) solo
allora potrai escludere l'ipotesi di un legame aspecifico del primario.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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