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domi84
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Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2010 : 11:42:02
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Funzionare funziona, ma se è un surface staining Ab
oltre la mezz'ora di incubazione inizierà a legarsi
dappertutto. Hai un controllo negativo appropriato?
(i.e. cellule negative per l'antigene testato) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2010 : 12:15:38
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Funzionare funziona, ma se è un surface staining Ab
oltre la mezz'ora di incubazione inizierà a legarsi
dappertutto. Hai un controllo negativo appropriato?
(i.e. cellule negative per l'antigene testato)
non è un surface staining, deve entrare all'interno della membrana.
Sto solo settando un protocollo, quindi ho:
cell non trasfettate, senza Ab secondario
cell non trasfettate con Ab primario e secondario
cell trasfettate con Ab primario e secondario
devo solo capire se questo Ab che abbiamo fatto funziona per FACS.
In teoria dovrei avere segnale 0 nel primo controllo
segnale 1 nel secondo (dovrebbe riconoscere l'endogeno)
segnale 100 nel trasfettato.
Quindi dici che può funzionare?! a 4°C ovviamente l'incubazione?
Grazie! |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2010 : 23:54:48
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Io faccio marcature intracellulari per fosforilazioni e ti direi
che allungare l'incubazione a un'ora o più è sicuramente una buona
idea. Overnight mi sembra francamente un po' tanto, ma non ho mai
provato. Il rischio è sempre quello: binding aspecifico. Se hai un
controllo negativo interno (i.e. il tuo antigene è espresso solo da
alcune cellule in coltura, non tutte) o esterno (i.e. un tipo cellulare
che non esprime l'antigene, incubato con gli Ab allo stesso modo) solo
allora potrai escludere l'ipotesi di un legame aspecifico del primario. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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FACS: Ab primario ON?
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