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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
 Inserito il - 08 ottobre 2010 : 20:41:37
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Ciao..oggi ho un bel problema di cui parlare. In settimana ho provato a co-immunoprecipitare due proteine, una legata al tag c-myc, e l'altra al tag FLAG. Per la coip ho usato la resina coniugata all'anticorpo a-myc da coniglio, e l'ho condotta su i seguenti campioni:
1)clone stabile esprimente la proteina legata al myc trasfettato con la proteina legata al flag
2)clone stabile esprimente la proteina lagata al myc (per controllare l'avvenuta IP sul clone non trasfettato)
3)clone stabile esprimente la proteina legata al flag (per controllare che la proteina legata al flag non venga immunoprecipitata CASUALMENTE con la resina)
4)IP su cellule wt
Quello che è successo è che a sorpresa andano a sviluppare i blot con l'anticorpo a-flag vedo una banda alla stessa altezza della proteina legata al flag non solo nelle cellule trasfettate (il che mi ha fatto pensare che la coip fosse riuscita), ma anche nella lane dove avevo caricato l'IP n°3. Secondo voi com'è possibile? tra l'altro negli input e output non sembrano variare granche i livelli della banda ricosciuta dall'anticorpo a-flag
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 20:55:01
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| non è che quello che vedi sia la Heavy chain (o Light Chain) dell'anticorpo stesso? |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 21:34:22
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| non credo perchè non vedo nessuna banda nelle ip 2 e 4, ma solo in quelle dove ho la proteina legata al flag. Inoltre la banda migra proprio dove attendo la mia proteina legata al flag. è possibile una cross reattività della resina antimyc sul flag (la resina è coniugata ad anticorpi policlonali) |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2010 : 23:36:31
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| ok. beh in tal caso sì, potrebbe essere una cross-reattività. Se provi ad usare altri anticorpi anti-myc? (che ne so, monoclonale anti-myc....) |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2010 : 08:55:58
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| il problema è che poi per i blot uso anticorpi monoclonali da topo, e quindi negli sviluppi mi comparirebbero le bande corrispondenti all'anticorpo usato per l'IP che sfiga vuole migri (quella della catena pesante) alla stessa altezza della proteina legata al flag...cmq è davvero strana una cross reattività degli anticorpo anti-myc per il flag...io non ne sono molto convinto però è anche vero che non saprei come spiegarmi il risultato. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2010 : 10:12:59
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beh ma se col blot riveli la catena pesante, e questa ti migra alla stessa altezza della tua proteina flag-tagged, mi pare che il problema sia risolto. Potresti quindi provare a usare qualche altro sistema per le immunoprecipitazioni. Io in passato ho usato le colonnine per affinità della pierce (ci leghi l'anticorpo che ti interessa covalentemente, poi ci fai passare le tue proteine... ed eluisci alla fine quelle che si legano all'ab e quelle che si legano alla stessa proteina). Non è che sia rimasto molto soddisfatto perchè mi ha dato un sacco di sporco.
Con le magnetic beads della invitrogen mi sono trovato molto meglio. In entrambi i casi il leakage dell'anticorpo è molto ridotto, se non annullato.
Altrimenti guarda un pò se riesci a risolvere in altra maniera.
Saluti |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2010 : 10:23:46
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In coltura hai quindi 3 linee cellulari da passare in momenti diversi:
1)esprimenti flag
2)esprimenti myc
3)wt
Può essere che hai cross-contaminato i cloni stabili esprimenti flag con quella che esprime il myc?
Se prendi l'IP3 e fai un WB anti myc, cosa esce? Se esce una banda allora hai cross-contaminato... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2010 : 14:58:19
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x spermannorganizer:
usando per i blot un anticorpo da topo e per l'ip uno ab da coniglio, nel blot non vedo le catene pesanti. infatti nelle ip condotte sulle cellule esprimenti la proteina legata al myc e sulle wt, l'anticorpo anti-flag non riconosce nessuna banda.
x domi84:
lunedì sviluppo con l'anti-myc e ti faccio sapere, ma mi sembra abbastanza improbabile.
l'ultimo dubbio che mi viene è che magari aumentando il numero dei lavaggi (ne faccio 4x0.5 mL con TBS) potrei staccare ulteriormente ciò che non si è legato in modo specifico oppure fare dei lavaggi più stringenti aumentando la concentrazione di NaCl nel TBS da 150 mM a 0.4M..che ne dite? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2010 : 18:59:52
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Caio Paolo
non so se ti consolerà... ma mi son trovata anche io in situazioni simili: secondo me è possibilissimo ke la tua proteina-flag over-espressa sia "appiccicosa" e si leghi in maniera aspecifica alla resina.
Io procederei innanzitutto aumentando i lavaggi (ad esempio 5 invece di 4) e magari aggiungendo un detergente al buffer con cui fai i lavaggi: io in genere li faccio con il buffer della co-ip, che contiene un detergente. Inoltre puoi fare almeno un lavaggio mettendo i campioni u una ruota a 4°4 per 10 min.
Inoltre, non so quanto hai immunoprecipitato, ma in overespressione di entrambe le prot io non immunoprecip + di un milligrammo (+ materiali usi, + è facile che tu vedaanche legami aspecifici).
Altra possibilità,è quella di fare l'IP inversa, immunoprecip con anti-flag: magari la prot-myc è meno appiccicosa...
Nei casi + estremi, ho usato molte altre accortezze, ma spero tu possa risolvere con queste. 
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Ascoltami con gli occhi... |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2010 : 21:02:49
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| ti ringrazio gst.. tutte le accortezze che mi hai detto le ho già pensate ma purtroppo non so se riuscirò a provarle tutte perchè purtroppo il periodo di tesi si sta per concludere...mi sa tanto che rimarrò alla fine con tanti dubbi e nessuna certezza sui risultati ottenuti..l'importante è cmq aver visto che da solo riesco ad avere qualche idea su come risolvere certi problemi anche se la mia esperienza in lab è ancora poca |
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