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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
 Inserito il - 12 ottobre 2010 : 15:30:26
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Ragazzi/e ho un problema!
Uno dei tanti.
Sto cercando di vedere se e quanto la mia Small Molecule incida sulla mortalità cellulare.
Ho piastrato le cellule in multiwell da sei. E ho un trattato rispetto al controllo.
Vedo al microscopio ottico che effettivamente le cellule muoiono (sono cellule che crescono solo in adesione, quindi quelle morte per lo più sono quelle in sospensione), ed effettivamente ad occhio la % delle cellule in sospensione dei trattati è superiore rispetto alla controparte non trattata.
Allora:
-Raccolgo il terreno in una falcon da 15
-Lavo con PBS il pozzetto e raccolgo il pbs nella stessa falcon
-tripsinizzo, annullo la tripsina con terreno fresco e tutte le
cellule le raccolgo nella stessa falcon
-centrifugo 1.2 rpm per 5 minuti
-risospendo in 1 ml
-prelevo una aliquota e diluisco in trypan.
-guardo al microscopio nella cameretta di burker
...risultato? Tutte cellule vive!!! % di cellule morte IN OGNI CASO è una su diecimila circa.
Come è possibile secondo voi? E' questo il risultato e le cellule che io vedo "galleggiare" sono vive? Sbaglio qualcosa e mi perdo le cellule morte?
AIUTATEMI GRAZIE!!
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2010 : 09:27:59
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il rapporto è 1:1 con l'aliquota di cellule. In genere prendo una aliquota di 30 uL di cellule e altrettanti di trypan. Poi dieci uL per cameretta.
Ci sono altri modi per risalire alla mortalità? |
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memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2010 : 12:39:09
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Io utilizzo una diluizione 1:10 rispetto al campione e la differenza la vedo
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King D
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Acerra
98 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2010 : 10:17:05
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anche io uso la diluizione 1:10 e c'è sempre differenza.
Un problema può essere che il tuo farmaco incida sulla cellula impedendole di aderire e quindi la ritrovi in sospensione, ciò non vuol dire che sia effettivamente morta!
Al microscopio ottico (io uso quello rovesciato) puoi apprezzare la differenza tra cellula viva e morta semplicemente guardando la birifrangenza della membrana cellulare: se essa è bella luminosa non per forza la cellula è morta.
Però, usando diversi farmaci, anche io mi sono accorto che cellule che, ad una prima osservazione, consideri morte risultano essere vive col saggio trypan.
Allora una differenza la puoi ottenere valutando la % di inibizione rispetto al tuo controllo. |
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juliette85
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2010 : 12:05:31
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| allora...la spiegazione non te la so dare, ma volendo potresti determinare con lo spettrofotometro, se ce l'hai, il rilascio di LDH (lattico deidrogenasi) sul surnatante (il terreno). Così facendo avresti una misura molto molto sensibile della mortalità cellulare. Altrimenti puoi provare a quantificare le proteine...noi usiamo il kit BCA (acido bicinconinico)..almeno puoi vedere se hai effettivamente meno proteine nel trattato rispetto al controllo... |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2010 : 09:36:57
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Grazie a tutti per le risposte/consigli! Proverò e vi farò sapere!
kri |
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Discussione |
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calcolo Mortalità Cellulare
Didattica e Relazioni
