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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
 Inserito il - 22 ottobre 2010 : 16:46:30
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Visto che posso allegare files, ve ne allego uno.
Western blot. In sostanza non ho nessun particolare problema, ma come dicevo nel titolo, e come potrete vedere, mi si presenta 8 volte su 10 (e credo non sia solo questione della bontá o meno degli anticorpi), uno strano background nella zona centrale del film. A volte solo un contorno come in questa foto, altre volte anche l'interno di quel rettangolo si annerisce. Diciamo che, almeno in questo caso, non mi da fastidio se le bande sono al di fuori del range da 60-70 KDa (male, visto che uso la tubulina come housekeeping) o da 20-25 KDa. L'unico rimedio che ho trovato ora e' fare correre molto di piu' o meolto di meno il mio gel, in modo da pilotare il mio target al di fuori del background.
Nella foto potete vedere come una linea mi passa perfettamente al di sopra delle mie bande. Inutile ricordarvi quanto mi faccia incazzare 
Vi e' mai successo niente del genere? Come avete rimediato o come mi suggerite di rimediare?
Immagine:
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2010 : 22:08:19
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per me è un problema di sviluppo... non è che intanto che metti la soluzione di sviluppo la muovi? oppure non la togli completamente prima di esporre?
ciao ciao
elly_ |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2010 : 10:48:50
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Dubito. uso l'Immobilion Western della Millipore. Incubo 5 minuti (usando meno della meta' della quantita' consigliata), dopo di che tolgo il substrato e vado in camera oscura.
Se fosse come dici tu dovrebbe succedermi sempre, mentre accade solo con gli anticorpi che mi danno un segnale debole, per cui devo aumentarne la concentrazione o il tempo di esposizione.
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2010 : 23:08:46
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in genere i difetti di sviluppo si hanno proprio con anticorpi deboli... perchè esponendo di più ti verranno peggio.
ciao ciao |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 08 novembre 2010 : 10:40:34
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OK, ma questo pattern di background non é bizzarro? E' davvero ricorrente...
Ho provato ovviamente a giocare anche con le diluizioni degli anticorpi o anche ad aumentare la quantita´ di proteine per pozzetto, ma il guadagno é stato scarso... |
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