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RM
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 Inserito il - 22 ottobre 2010 : 18:04:12
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Ciao a tutti
Devo fare un western blot su una proteina che viene secreta dalle cellule. Mi chiedevo se qualcuno ha un buon metodo per analizzare il terreno di coltura tramite wb. Conviene precipitare con (magari con acetone/tca) e concentrare le proteine? qualcuno ha esperienza con questo tipo di esperimento?(es quante cellule/mL di dmem usare)
Grazie
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Morfeo
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Città: Roma
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Inserito il - 22 ottobre 2010 : 21:22:22
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Io lavoro su proteine che vengono secrete nel terreno di coltura. Ti posso dire che prelevo il supernatante, aggiungo l'inibitore delle proteasi PMSF e dopodichè utilizzo dei concentratori per appunto concentrare la proteina. A questo punto procedo col Western.
P.S: lavoro con i lieviti. |
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RM
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115 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2010 : 12:20:51
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Grazie per la risposta
Per concentratori intendi delle colonne? volevo anche chiederti se dosi le proteine dopo averle concentrate e, se sì, quante proteine usi per il wb
Ciao |
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_pietro_
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Città: Lund
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Inserito il - 23 ottobre 2010 : 13:30:04
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Citazione:
Messaggio inserito da Morfeo
Io lavoro su proteine che vengono secrete nel terreno di coltura. Ti posso dire che prelevo il supernatante, aggiungo l'inibitore delle proteasi PMSF e dopodichè utilizzo dei concentratori per appunto concentrare la proteina. A questo punto procedo col Western.
P.S: lavoro con i lieviti.
Anch'io mi sto apprestando a fare alcuni studi su proteine secrede. Ma non hai il problema del BSA? |
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Morfeo
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Città: Roma
110 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2010 : 16:18:55
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Citazione:
Grazie per la risposta
Per concentratori intendi delle colonne? volevo anche chiederti se dosi le proteine dopo averle concentrate e, se sì, quante proteine usi per il wb
Ciao
Intendo gli Amicon Ultra, sono delle falcon che hanno un filtro che presenta dei pori: così conoscendo il peso molecolare della tua proteina, tramite varie centrifugate puoi appunto "concentrare". (funzionano ad esclusione molecolare, come un setaccio). Io il dosaggio non lo faccio al momento perchè sto mettendo a punto la purificazione. Poi dipende molto da su che proteina lavori (quale?), dai livelli di espressione e tante cose.
Citazione:
Anch'io mi sto apprestando a fare alcuni studi su proteine secrede. Ma non hai il problema del BSA?
Cosa intendi? |
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RM
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115 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2010 : 20:36:29
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[quote]Messaggio inserito da Morfeo
Intendo gli Amicon Ultra, sono delle falcon che hanno un filtro che presenta dei pori: così conoscendo il peso molecolare della tua proteina, tramite varie centrifugate puoi appunto "concentrare"[quote].
Si ho capito quali intendi.
Grazie mille
[quote]Poi dipende molto da su che proteina lavori (quale?), dai livelli di espressione e tante cose.[quote]
La proteina è di circa 25 Kda, ma comunque non si tratta di una purificazione. Devo semplicemente capire se, in seguito ad un dato stimolo, questa viene secreta o no rispetto al controllo non stimolato
Ciao e grazie |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
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Inserito il - 24 ottobre 2010 : 23:08:01
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Citazione:
Cosa intendi?
Diciamo che io sto cercando di vedere se i miei tessuti (lavoro su retina) secernono particolari sostanze e voglio vedere se esistono differenze tra il modello sano e il modello malato.
Il mio problema e' che le mie proteine (una di circa 130 KDa una versione troncata di circa 65 KDa che possono essere glicosilate e un altra che si aggira a cavallo dei 30 a seconda delle isoforme) spaziano in un range molto vasto, quindi se uso le colonnine che tu dicevi, me ne servirebbe una confezione per ogni proteina. Un gran casino.
Altro problema e' che queste proteine, con ogni probabilita', ammesso che siano secrete, lo saranno in bassa concentrazione, quindi ho l'obbligo di concentrare i miei campioni.
Ora nasce il mio problema: l'albumina di siero bovino, BSA, presente in altissima concentrazione nelle mie colture. Se concentro il campione, concentro anche il BSA. Il rischio e' che mi ingolfi la corsa elettroforetica (piu' che un rischio e'una certezza a queste concentrazioni). Se volessi anche tagliare il BSA con queste colonnine, purtroppo una delle mie proteine ha lo stesso peso approssimativo del BSA, per cui la perderei.
Sto sostanzialmente cercando un modo per sbarazzarmene. Ho provato delle colonnine della millipore (forse, ti scrivo da casa e onestamente non ricordo), si chiamano HiTrap, ma hanno l'inconveniente di legare anche altre proteine (e nemmeno tanto bene), per cui non ho la certezza del risultato. Ora ne ho trovate altre che provero' a suggerire al mio capo.. vediamo un po'.
Qualche suggerimento? |
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Iside
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_pietro_
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Inserito il - 26 ottobre 2010 : 12:27:55
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Lo faró, grazie del pensiero   |
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RM
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RM
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_pietro_
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Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2010 : 09:36:00
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Grazie a entrambi...
ho scaricato paper e datasheets, ma "purtroppo" ora non ho tempo di leggerli. Sono alle prese con qualche buon risultato che hanno la precedenza. Ma appena prendo/iamo una decisione, vi varo' sapere cosa e se ha funzionato..
Grazie ancora e a presto |
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WB su proteina di secrezione
Didattica e Relazioni
