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Discussione |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 18 settembre 2006 : 17:23:07
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Una domanda riguardo l'analisi dell'RNA ,
apparentemente semplice ma che mi mette in difficoltà.
In che senso la RT-PCR è una tecnica di analisi
"che può essere anche semi-quantitativa" ?
Se è vero che il Northern blot è una tecnica
qualitativa (perchè permette di discriminare
determinate sequenze) e quantitativa (perchè
l’intensità del segnale rivelato dipende dal numero
di molecole di sonda marcata che ha ibridato la sequenza
specifica), allora perchè non è possibile fare un discorso
analogo per la RT-PCR? Che cosa le distingue a tal punto?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2006 : 18:26:00
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Devi renderti conto che la reazione a catena della DNA polimerasi è una reazione in vitro, quindi soggetta ad una merea di fluttuazione casuali (Operatore, reagenti usati al momento dell'esperimento..ecc) spesso incontrollabili, che potrebbero darti valori così diversi esperiemnto dopo esperimento da non poterli gestire nel dare un dato certo e definitivo, al massimo può solo darti una indicazione di come stanno realmente le cose (da cui semiquantitativa). Il northern blot, se standardizzato ageguatamente, cristalliza su un filtro la situazione del tuo trascritto al momento dell'estrazione dell'RNA (se estratto correttamente) senza nessun artificio tecnico quale è la PCR.
Discorso diverso per la real-time PCR, tecnica potrentissima di quantificazione, grazie alla quale è possibile ottenere lo stesso dato facendo lo stesso esperimento sullo stesso campione (se conservato a regola d'arte) un mese dopo; nonostante tutto una scrupolosa standardizzazione è fondamentale; e ti posso assicurare che tale standirdazione ti può portare via più tempo degli esperimenti veri e propri. Ma alla fine tutto si trasforma di un vero divertimento e la quantitativa ti sempra un gioco da ragazzi.
Ciao |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2006 : 18:56:58
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Grazie Patrizio, sei stato molto chiaro 
dunque posso concludere che la RT-PCR è da definirsi
'semiquantitativa' solo quando l'amplificazione
NON è associata ad una real time quantitativa? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2006 : 20:03:10
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Bravo, sono contento che hai capito |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2006 : 22:51:53
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Concordo, inoltre ricorda anche che la PCR classica è una PCR end-point, cioè vai ad analizzare il tuo risultato quando ormai sei arrivato alla fase di plateau dell'amplificazione, quindi non puoi sapere quanto DNA avevi in partenza.
In real time invece analizzi l'inizio della fase esponenziale, quindi matematicamente puoi definire quanto DNA c'era all'inizio (perchè ad ogni ciclo il numero di molecole raddoppia).
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2006 : 23:19:19
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| Esatto Nico, ed aggiungo che nella fase esponeziale la reazione di PCR è massima (reagenti al TOP della loro effiecienza) ed è immune alle normli fluttuazioni causali che inevitabilmente si presentano nella fase di PLATEAU |
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bububebè
Utente Junior
Prov.: Na
Città: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 08 novembre 2010 : 22:39:10
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Ciao a tutti ragazzi!!!
Non scrivo da molto ma il sito lo consulto sempre!!!
Ragazzi tra poco ho l esame di biologia molecolare clinica, e mi trovo proprio in tilt! Ho letto e riletto tutti i post su questo argomento ma.... NON HO CAPITO!!
Vi prego me lo potete spiegare come si fa con i bambini??
Allora non ho capito la differenza tra queste metodiche,non capito se si fanno a partire dall'RNA convertito in cDNA, se è previsto anche normale DNA genomico....boh!!!! aiutatemi per favore! |
 ★°•. єѕтяєℓℓα .•°★ |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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bububebè
Utente Junior
Prov.: Na
Città: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 09 novembre 2010 : 13:36:00
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Allora non ho capito la differenza tra PCR-quantitativa (Real Time) e semiquantitativa...
Quando si decide di fare una e quando si decide di fare l'altra? Quello che so è che la PCR-semiquantitativa permette di fare dosaggio genico, partendo dal Gene Analizzato (GA) a dose ignota confrontato col Gene di Riferimento (GR) a dose nota; si effettua l'amplificazione fino alla fase esponenziale e poi mediante elettroforesi capillare si valuta l'altezza dei picchi generati, proporzionale alla quantità di amplificato presente, e quindi al campione esaminato... si calcola R1 (GA/GR) per il soggetto normale e R2 per il soggetto in esame e poi si valuta l'ID e si osserva se il soggeto è duplicato o deleto. Questa tecnica si applica a partire dal DNA o RNA? o è indifferente??
La Real Time invece, metodo cinetico che permette di quantificare un ac.nucleico mediante sostanze e sonde fluorescenti, si fa SOLO dopo una RT-PCR? o si può fare anche con DNA?
Please Chick help me |
★°•. єѕтяєℓℓα .•°★ |
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Quantitativo e Semiquantitativo
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