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sgrencino
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 26 novembre 2010 : 13:47:22
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La miglior conservazione delle proteine è consigliabile su membrana di nitrocellulosa o su gel di poliacrilammide?
Quali sarebbero le condizioni ottimali per la conservazione delle membrane di nitrocellusa blottate?
Per quanto tempo si potrebbero conservare le membrane senza osservare sostanziali variazioni della successiva reazione immunoenzimatica?
Per quanto riguarda la procedura di recupero dell’anticorpo:
vi sarebbe la possibilità di recuperare l’ Ab primario? Se si, che protocollo consigliereste?
Vi sarebbe la possibilità di recuperare anche l’Ab secondario?
Se si, che protocollo consigliereste?
Per circa quante volte sarebbe possibile riutilizzare gli anticorpi e in condizioni si dovrebbero conservare ?
Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?
Grazie in anticipo per le risposte
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 27 novembre 2010 : 16:26:07
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Allora, ti rispondo punti per punto:
1) Nitrocellulosa
2) per la conservazione delle membrane di nitrocellusa blottate lasciale in scatoline o bustine con PBS, in maniera tale che la soluzione ricopra interamente la membrana..si può conservare così anche per linghi tempi, bisogna però controllare il livello di pBS che tende ad evaporare col tempo
3) qualche mese (5-6), dopo un anno non la userei più...
4) Per recuperare l'Ab primario basta trasferire la diluizione dell'anticorpo in PBST o TBST a seconda che hai incubato con la membranain una falcon e riusarla coaì x il prossimo WB
5) idem x il secondario
6) si possono riutilizzare qualche volta, 2-3, e basta conservare in frigo (4°C)
7) un anticorpo spesso si conserva in frigo e ci sono anche alcuni Ab che non si devono assolutamente congelare, quindi 4°C va benissimo e si possono conservare per decine di anni senza perdere troppa funzionalità...in genre si comprano si mettono in frigo e li si usa finchè non finiscono (la provetta originale intendo, le diluizioni in PBST o TBST, ripeto, al max 2-3 volte)
Questo tutto in base alla mia esperienza annosa...he he he
Spero sia stato esaustivo |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2010 : 16:19:05
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Ti rispondo secondo la mia esperienza:
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Messaggio inserito da sgrencino
La miglior conservazione delle proteine è consigliabile su membrana di nitrocellulosa o su gel di poliacrilammide?
decisamente su nitrocellulosa o PVDF
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Quali sarebbero le condizioni ottimali per la conservazione delle membrane di nitrocellusa blottate?
dopo aver colorato con ponceau, io asciugo la membrana con carta 3mm e poi la lascio secca fino a quando mi serve, conservata in un foglio di plastica trasparente. Ho blottato anche membrane conservate per più di un anno così.
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Messaggio inserito da sgrencino
Per quanto tempo si potrebbero conservare le membrane senza osservare sostanziali variazioni della successiva reazione immunoenzimatica?
Mi ripeto, su membrana secca anche anni.
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Messaggio inserito da sgrencino
Per quanto riguarda la procedura di recupero dell’anticorpo:
vi sarebbe la possibilità di recuperare l’ Ab primario? Se si, che protocollo consigliereste?
Vi sarebbe la possibilità di recuperare anche l’Ab secondario?
Se si, che protocollo consigliereste?
E' buona procedura recuperare il primario, specie per gli housekeeping e i primari che funzionano bene. semplicementi li metti in falcon dopo averli usati, aggiungendo N3Na allo 0,02%. I secondari lasciali perdere, anche perchè in genere si usano così diluiti che non ne vale la pena. In più, se volessi recuperarli li dovresti sempre conservare con 0,02% di N3Na per evitare che crescano schifezze, però l'N3Na interferisce con il saggio della perossidasi, quindi meglio farseli freschi
Citazione:
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Per circa quante volte sarebbe possibile riutilizzare gli anticorpi e in condizioni si dovrebbero conservare ?
finchè funzionano! l'anti GAPDH io lo uso fino a 10 volte senza problemi
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Messaggio inserito da sgrencino
Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?
quì chiarisci meglio: parli di ab già diluiti o di stock?
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2010 : 19:19:47
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io l ho fatto proprio oggi!
dopo il blotting su nitrocellulosa ho colorato cn ponceau, poi lavato cn H2O bidistillata e conservata in busta di plastica trasparente cn un po' di acqua a 4°C!
ziaoooooooooooooo |
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sgrencino
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2010 : 09:51:32
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Messaggio inserito da sgrencino
Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?
quì chiarisci meglio: parli di ab già diluiti o di stock?
Dato che stò usufruendo della tua disponibilità, vorrei sapere tutte e due!  comunque la domanda era per Ab diluiti.
ps: grazie mille |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2010 : 10:01:28
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| ma secondo voi, un anticorpo diluito se viene conservato a -20, e che quindi si congela, nel riutilizzarlo perde funzionalità? Meglio a 4 gradi? |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2010 : 11:18:33
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Messaggio inserito da sgrencino
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Messaggio inserito da sgrencino
Questi una volta scongelati per quanto tempo sono conservabili gli anticorpi e in che condizioni?
quì chiarisci meglio: parli di ab già diluiti o di stock?
Dato che stò usufruendo della tua disponibilità, vorrei sapere tutte e due! comunque la domanda era per Ab diluiti.
ps: grazie mille
Gli ab diluiti li tieni a +4°C in N3Na 0.02%. Io ho usato una anti actina conservata dal 2006 così e ho avuto uno splendido segnale. Per gli stock, segui le istruzioni del datasheet. Per ab da tenere a -20°C la cosa migliore sarebbe aliquotare.
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Immuno Blotting domande a cui non trovo risposta
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