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valeriamassa
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
64 Messaggi |
 Inserito il - 24 settembre 2006 : 14:09:48
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Ciao! Qualcuno sa dirmi che protocollo posso usare per separare, possibilmente tramite SDS-PAGE (e non Blue-native)una proteina da 10 Kda? Devo usare un gradiente di acrilammide? I need HELP, please!!!
Baci
Vale
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valeria |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2006 : 11:53:34
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Ciao Vale!
Per separare una proteina da 10KDa basta usare un gel di acrilamide ad una pecentuale di 15% o 20% (o ovviamente vie di mezzo! ad es.17,5% hai una buona risoluzione) non è necessario fare un gradiente se non vuoi visualizzare bene sullo stesso gel anche proteine ad un peso molecolare maggiore!
Ciao  |
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valeriamassa
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
64 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2006 : 18:37:48
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GRAZIE GFPina!!
Il tuo nick è davvero carino! Complimenti per la scelta!
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valeria |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2006 : 11:14:41
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Grazie!!!!   |
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lyla
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
31 Messaggi |
Inserito il - 12 ottobre 2006 : 20:58:11
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| salve io volevo sapere invece in generale che protocollo mi consigliate per un western blot in cui vorrei visualizzare una proteina sola in particolare di 38289 Da e possibilmente un modo consigliato per -grosso modo- stimarne la concentrazione. grazie lyla |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2006 : 18:11:27
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Ciao lyla,
scusa ma non ho capito bene che protocollo specifico hai bisogno.
Ti riferisci ad un protocollo generale per western blot?
Per visualizzare la tua proteina devi utilizzare un gel adatto, percentuali attorno al 10-12% vanno bene. E poi blottare e utilizzare un anticorpo specifico per la tua proteina, un normale western blot.
Presumo che tu abbia un lisato, oppure hai la proteina purificata?
Per stimare la concentrazione (a parte che io non sono molto d’accordo con la quantificazione in western blot) puoi marcare la tua membrana con l’anticorpo per un gene housekeeping x es. beta-actina (che sempre in teoria è ugualmente espresso in tutti i campioni) poi dovresti utilizzare uno scanner e un software per analizzare l’intensità di segnale.
Io in genere prima di fare un western calcolo la concentrazione proteica totale dei miei campioni e ne semino una quantità fissa, così posso discriminare le differenze tra i vari campioni.
Scusa se la mia risposta è un po’ vaga ma bisognerebbe capire esattamente cosa devi fare.
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lyla
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
31 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2006 : 11:24:51
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scusami sono io che quando ho scritto andavo un pò di fretta, allora io al momento ho raccolto delle cellule da un apiastra con il 2xsample buffer, cellule in cui ho silenziato un gene, e vorrei vedere effettivamente la dowregolazione di questo attraverso una sottoespressione a livello proteico, western blot ne ho fatti ma volevo un confronto per vedere delle varianti,sempre mi valuto la concentraz prima e non sono daccordo alla stima con il w blot, non è adatto...però da poco ho cambiato laboratorio e il mio capo preferirebbe così, quindi volevo sapere se qualcuno lo fa, ha degli accprgimenti per potersi "fidare" della stima quantitativa ottenuta con il western. spero di essermi fatta capire meglio. .... e scusatemi! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2006 : 12:02:03
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Ah ok!
Secondo me quello che potresti fare è seminare la stessa quantità dei tuoi campioni e del controllo poi ibridare la membrana 2 volte 1 per la tua proteina e 1 per una proteina house keeping. In modo da avere entrambe le bande sulla stessa lastra.
Poi fai un confronto della intensità delle bande, la proteina house keeping dovrebbe essere uguale in tutti i campioni e quindi la usi per normalizzare i tuoi risultati, e poi confronti le differenze nella tua proteina.
Poi per analizzare i risultati (intensità delle bande) so che ci sono dei programmi su internet, io però non li ho mai usati personalmente e quindi non posso consigliarti.
In questo modo comunque ti metti nelle condizioni più uniformi possibile in modo che la quantificazione sia la più affidabile possibile!
Spero di averti aiutato!
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lyla
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
31 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2006 : 21:44:28
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gfpina grazie, ma come faccio ad avere due segnali sulla stessa lastra, facendo lo stipping io stacco il primo anticorpo, scusami forse sono un pò stanca e qualcosa mi sfugge. ....comunque si credo di usare la proteina hkeeping,mi avevano detto, ma mi sembra un metodo molto approssimativo e comunque semiquantitativo. grazie lo stesso. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2006 : 11:57:31
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Citazione:
Messaggio inserito da lyla
gfpina grazie, ma come faccio ad avere due segnali sulla stessa lastra, facendo lo stipping io stacco il primo anticorpo,
Semplice non devi fare lo stripping!!! 
Io non faccio mai lo stripping e spesso visualizzo due proteine sulla stessa lastra.
Dopo aver sviluppato la lastra con il primo anticorpo lavi semplicemente in TBS/Tween per elimniare la sostanza chemioluminescente e poi ricominci da capo per il secondo anticorpo. Io metto direttamente l'anticorpo, ma c'è anche chi ripete il blocco!
Ovviamente il segnale del primo anticorpo la seconda volta che sviluppi sarà più debole ma c'è ancora!!!
In teoria si potrebbero anche mettere entrambi gli anticorpi e poi sviluppare una volta sola (io non l'ho mai fatto!) ma dovresti prima provare entrambi gli anticorpi singolarmente sui tuoi lisati per essere sicura esattamente a quale anticorpio corrisponde ogni singola banda che visualizzi sulla lastra!
Citazione:
ma mi sembra un metodo molto approssimativo e comunque semiquantitativo.
si in effetti... ma con il western blot purtroppo è così!
Per quantificare dovresti fare ad es. un elisa per la tua proteina... ma è tutto un'altro discorso.
Comunque così almeno una "semi"quantificazione ce l'hai!
Beh buon lavoro!!!
Ciao |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2006 : 18:19:05
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Semplice non devi fare lo stripping!!!
Io non faccio mai lo stripping e spesso visualizzo due proteine sulla stessa lastra.
Dopo aver sviluppato la lastra con il primo anticorpo lavi semplicemente in TBS/Tween per elimniare la sostanza chemioluminescente e poi ricominci da capo per il secondo anticorpo. Io metto direttamente l'anticorpo, ma c'è anche chi ripete il blocco!
Ovviamente il segnale del primo anticorpo la seconda volta che sviluppi sarà più debole ma c'è ancora!!!
In teoria si potrebbero anche mettere entrambi gli anticorpi e poi sviluppare una volta sola (io non l'ho mai fatto!) ma dovresti prima provare entrambi gli anticorpi singolarmente sui tuoi lisati per essere sicura esattamente a quale anticorpio corrisponde ogni singola banda che visualizzi sulla lastra!
uhm.... uhm....
questa cosa mai sentita.
forse usi degli anticorpi con segnali-bomba?
come fa a rimanere il segnale del primo anticorpo se il liquido di sviluppo ha un segnale che ha un picco nel primo quarto d'ora e poi decade nel tempo? Mah! cmq c'e' sempre da imparare... |
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lyla
Nuovo Arrivato
Città: Napoli
31 Messaggi |
 Inserito il - 17 ottobre 2006 : 18:59:54
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oh dio! io mi chiedo la stessa cosa di byo-gio.come è possibile?PROVERò COMUNQUE GRAZIE MILLE. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2006 : 10:25:03
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Ciao a entrambi!
Non stupitevi non è una cosa così strana, molti lo fanno (non solo io!).
E vi assicuro che funziona!!!
Ovviamente come ho già detto il segnale del primo anticorpo la seconda volta sarà ridotto, ma non sparisce!
Citazione:
come fa a rimanere il segnale del primo anticorpo se il liquido di sviluppo ha un segnale che ha un picco nel primo quarto d'ora e poi decade nel tempo?
perchè quando fai avvenire la reazione chemioluminescente la seconda volta per il secondo anticorpo la soluzione si lega anche dove è presente il primo anticorpo (che durante i vari passaggi non si stacca dalla membrana), si ha quindi una nuova reazione (a livello della banda del primo anticorpo) che sarà però meno intensa della prima.
Spero che sia chiara la mia spiegazione!
Comunque facendo una ricerca su google per "reblotting" trovate alcuni articoli dove questo è stato fatto, ad es. questo:
http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/109/6/770
fig 1B
e si usa appunto per quantificare!
P.S. x byo_gio purtroppo non ho anticorpi con segnali bomba... magari!! è così difficile trovarne uno che funzioni bene! Anzi a dire la verità se il segnale è troppo intenso non va molto bene perchè la reazione chemiolminescente è troppo forte, si brucia la membrana (puoi vedere delle bande marroncine sulla membrana stessa) e la seconda volta non avviene più la reazione, ma al contrario sulla lastra vedi come se ci fosse un buco (come se avessi il negativo, la banda trasparente e attorno tutto nero!) |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 18 ottobre 2006 : 20:57:45
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Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
perchè quando fai avvenire la reazione chemioluminescente la seconda volta per il secondo anticorpo la soluzione si lega anche dove è presente il primo anticorpo (che durante i vari passaggi non si stacca dalla membrana), si ha quindi una nuova reazione (a livello della banda del primo anticorpo) che sarà però meno intensa della prima.
Spero che sia chiara la mia spiegazione!
allora: mi fido e ci credo che funziona... solo che approfitto di questo forum per imparare cose che non so o che non mi risultano. Quindi visto che magari sei + ferrata di me sull'argomento, ti chiedo lumi.
io uso secondari coniugati con un enzima HRP, il liquido ECL (Amersham) funge da substrato per l'enzima HRP e contiene un estere di acridina.
Quando unisci i due reagenti del liquido ECL e li metti a contatto della membrana, dovrebbe succedere che: "Un enzima funziona da catalizzatore che agisce sul substrato per accelerare la sua conversione a prodotto mediante la formazione un complesso intermedio enzima-substrato"
Quindi credo che sia:
enzima + substrato(estere di acridina allo stato fondamentale)--> enzima-substrato --> enzima + prodotto(estere di acridina allo stato eccitato)+emissione di luce a 430 nm
Inoltre io so che in questa reazione l'enzima non viene consumato ma può reagire con altre molecole di substrato per formare altre molecole di prodotto, e che quindi una singola molecola di enzima può trasformare più molecole di substrato in prodotto: tutto questo permette l'amplificazione dei segnali "deboli" in partenza...
Pero' non sapevo che l'enzima coniugato al secondario, anche dopo diverse reazioni e diversi "stress" come blocking, lavaggi vari, continuerebbe a funzionare anche se meno di prima? Quindi se uno sviluppo viene male ha senso fare di nuovo lavaggi e provare a risviluppare? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2006 : 12:26:43
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Ciao byo_gio!
Io sapevo che i kit per la chemioluminescenza contengono LUMINOLO e ACQUA OSSIGENATA, io al momento non uso l’ECL ma quello di un’altra marca, ma a quanto ne so sono basati tutti sullo stesso principio (Ossidazione del luminolo) e quello che cambia sono le quantità dei reagenti, però non vorrei sbagliarmi.
La reazione comunque è questa:
http://wwwold.unict.it/dipchi/05Didattica/Corsionline/Coloranti/13_Fotochim/Web_13/chemilum02.htm
Citazione:
Quindi se uno sviluppo viene male ha senso fare di nuovo lavaggi e provare a risviluppare?
Beh dipende dal motivo per cui lo sviluppo è venuto male!
Se ci sono stati problemi con lo sviluppo della lastra dovuti ad es. alle soluzioni di sviluppo per la lastra, non a problemi legati alla membrana e alla reazione chemiluminescente, si.
Se invece il segnale è debole o ci sono problemi con le soluzioni chemiluminescenti, non penso abbia molto senso, la situazione non dovrebbe cambiare.
Un’altra cosa che si può fare però in caso di segnale debole è ricominciare da capo dalla incubazione con il primario. Cioè dopo lo sviluppo lavare bene con TBS/Tween è poi rimettere l’anticorpo primario, il secondario…. in realtà non so darti una spiegazione esauriente del perché funzioni, ma io ho salvato alcuni blot così.
Comunque spesso si lavora con materiali preziosi e di cui se ne hanno piccole quantità, quindi penso che tutto quello che si può fare per recuperare un esperimento venuto male vale la pena di farlo, male che vada non ottieni comunque niente… ma almeno ci hai provato!  |
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byo_gio
Nuovo Arrivato
Prov.: MI
Città: Milano
66 Messaggi |
Inserito il - 19 ottobre 2006 : 19:18:32
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rimettere il primario senza strippare??? beh... se mi capita ci provero'!
grazie mille delle dritte. |
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Discussione |
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western blot su proteine da 10Kda
Didattica e Relazioni
