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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2010 : 18:08:36
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ciao ragazzi, scusate se ho posto un po' di domande a riguardo già in post precedenti,ma sto cercando qualcuno che ha studiato proteine N-glicosilate per chiedere consigli su come si può capire se la tua proteina è glicosilata o meno. ciao e grazie a chiunque saprà darmi un consiglio
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2010 : 20:57:16
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La cosa più stupida che mi viene in mente è usare lectine per legare eventuali proteine glicosilate.
Oppure potresti condurre una SDS-PAGE sulla proteina di indagine e poi trattarla con glicosidasi per evidenziare eventuali variazioni della la mobilità elettroforetica.
Oppure ancora far esprimere la proteina di interesse in un batterio e ripetere l'esperimento di elettroforesi, noto che i procarioti mancano di apparati di glicosilazione.
Un indizio sul suo stato potrebbe anche provenire dalla sua origine, se è una proteina sintetizzata nel citoplasma oppure se attraversa la via secretoria.
Mai provato nulla di tutto ciò, sono solo speculazioni teoriche, anche macchinose alcune, nella speranza che uppando qualcuno risponda :) |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2010 : 21:17:06
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Aggiorno dopo lurkata sul web 
La mia seconda idea alla fine pare essere la migliore :epicwin: !
Esistono infatti endoglucosidasi come questa
http://www.neb.com/nebecomm/products/productP0704.asp
che sono in grado di tagliare la catena N-oligosaccaridica a livello del legame con l'Asn, di modo tale da liberarla. La reazione che catalizzano, inoltre, rende pressoché superfluo visualizzare la mobilità della proteina trattata e non-trattata, in quanto una volta effettuato il taglio l'Asn viene convertita ad Asp.
Se dunque sequenzi la tua proteina non trattata e trattata dovresti poter determinare anche quali residui vanno incontro a modificazione post-traduzionale individuando i nuovi residui di aspartato.
Nel caso comunque tu non disponessi a breve termine della possibilità di sequenziare la tua proteina, non tutti, da quel che mi dicono, hanno a portata di mano un bello spettrometro di massa, potresti comunque rilevare le N-glicosilazioni con un'elettroforesi, dal momento che solitamente la perdita delle catene N-oligosaccaridiche, di dimensioni anche notevoli, varia la mobilità elettroforetica (possibilità già ventilata nel post precedente, ma ora confermata da foto di alcuni gel trovate sul web).
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 03 dicembre 2010 : 22:48:12
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confermo quanto detto da obarra1, l'uso di glicosidasi rimuove i residui oligosaccaridici e quindi varia la mobilità elettroforetica della proteina. Puoi usare questo sistema, oppure lectine e vedere se ti legano la tua proteina (e quindi capire se si tratta di una glicoproteina).
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 04 dicembre 2010 : 13:16:24
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| Vi ringrazio per i consigli...in realtà erano tutti metodi che avevo più o meno già visto facendo una ricerca in letteratura, ma volevo sapere se qualcuno di voi aveva già avuto esperienze simili e poter così sceglierne solo uno che risulti magari migliore degli altri(visto che i soldi scarseggiano!). Penso comunque che opterò per l'uso di glicosidasi perchè è quello che mi ispira più fiducia..ho visto che la sigma e l'invitrogen producono anche dei kit per la rilevazione su gel o membrana, ma visto il costo e le poche referenze a riguardo non mi fido a spendere molti soldi per questi kit..se poi qualcuno di voi li ha usati e me li consiglia allora potrei pensare di fare un sacrificio economico in più..ciao ciao |
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N-glicosilazione
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