Fosforilazione inserto clonaggio blunt

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Pearly
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9 Messaggi

Inserito il - 19 marzo 2011 : 18:38:58

Ciao a tutti,
ho un dubbio: � necessario fosforilare l'inserto dopo aver fatto il fill-in con la Klenow? Se si che protocollo mi consigliereste?
Inoltre dopo aver bluntato devo purificare su gel o basta inattivare l'enzima con il calore?

Un'altra domanda su Klenow:
navigando su internet ho scoperto che l'attivit� esonucleasica 5'-3' del frammento di Klenow non � efficiente e che in caso di estremit� 3'protruding � meglio utilizzare la T4 DNA polimerasi. E' un'informazione attendibile?

Grazie

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 19 marzo 2011 : 23:49:45

Non c'� bisogno di fosforilare perch� i 5' del tuo inserto sono gi� fosforilati (a meno che non sia un prodotto di pcr con primer nn fosforilati e nn digerito... ma nn credo visto che si tratta di fill in).
Per quanto riguarda la seconda domanda,

forse ti riferisci alla attivit� esonucleasica 3'->5'. In tal caso la risposta � si', � meglio usare la T4
Fammi sapere se hai ancora dei dubbi

Pearly
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2011 : 13:54:36

Si esatto..intendevo l'attivit� esonucleasica 3'-->5'! GRAZIE!

Per� il dubbio sulla fosforilazione rimane. Se � necessario defosforilare plasmide in cui devo clonare l'inserto dopo la digestione enzimatica, vuol dire che l'enzima di restrizione pu� lasciare il gruppo fosfato sul 3', quindi il corrispondente 5' del frammento exciso non sar� fosforilato. Giusto?
Perci� anche se faccio il bluntaggio non � certo che le estremit� 5' dell'inserto siano fosforilate (nel caso in cui l'enzima crei estremit� 5' overhang)

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2011 : 22:45:24

Ciao pearly. Credo che tu abbia un po' di confusione. Il vettore in genere viene defosforilato, come dici tu (per prevenirne la ricircolarizzazione). I gruppi fosfato sono sempre sul 5' mai sul 3'(-OH).Quindi se defosforili togli i fosfati dal 5' del vettore.
Andiamo all'inserto: prendiamo il semplicissimo caso che tu amplifichi per pcr con dei primer che contengono dei siti di restrizione (poco importa, ai fini di questa spiegazione, che siano blunt o 5' o 3' overhang). Dopo aver amplificato, digerisci con i tuoi enzimi che tagliano tra un nucleotide e l'altro lasciando libera un estremit� 3' OH e una 5'-P (fosfato).
Es: EcoRI 5'GAATTC 3' --> 5' G-OH 3' 5'P-AATTC 3'
In poche parole la digestione stessa ti "scopre" il fosfato 5' che poi viene sfruttato nella reazione di ligazione.
Spero di esser stato chiaro.

Pearly
Nuovo Arrivato

9 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2011 : 22:54:29

Grazie mille!!!! Chiarissimo!

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