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ste7fano
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 31 marzo 2011 : 12:47:26
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Ho estratti proteici di macrofagi murini di linea e in laboratorio non riusciamo a normalizzare le bande di actina. Abbiamo utilizzato un anticorpo primario per l'actina anti rabbit (santa cruz)con diluizione sia 1:1000 che 1:2000 e un anticorpo secondario sempre antirabbit (santa cruz) con le stesse diluizioni! Dopo aver aggiunto 1 ml di l'ECL (Biorad) abbiamo esposto le lastre e come risultato abbiamo avuto bande piuttosto strane: sono molto espresse, grosse e con degli sbuffi sopra e sotto..non sono omogenee e non assomigliano alle bande sottili dell'actina, sembra quasi che ci sia una sovrapposizione di bande! inoltre in un caso (ab I 1:1000; ab II 1:2000) le bande presentavano zone chiare al loro centro..come se non si fosse legato l'anticorpo in quella zona! cosa può essere?
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2011 : 14:48:18
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Prova a postare il film, ma cosi' a occhio direi che hai un sacco di actina, quindi o diluisci un bel po' i tuoi anticorpi (non posso dirti quanto, ma a occhio farei 1:10.000 (almeno). Ho avuto una situazione simile con un altra proteina e anche dluendo l'anticorpo 10 volte non ho avuto problemi di segnale.
Le zone chiare possono anche essere dovute a sovraesposizione, niente di piu' semplice |
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 31 marzo 2011 : 18:27:48
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| Concordo con _pietro_ ..io diluirei il secondario almeno 1:10000/1:15000 e farei delle esposizioni brevi (da 10'' a 2'). Per esperienza il secondario 1:2000 o 1:1000 mi sembra esagerato. Altra cosa che potresti provare a fare è caricare meno campione (meno gamma di proteine) su gel. |
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ste7fano
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2011 : 10:49:45
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| Grazie ad entrambi:) oggi facciamo correre un altro gel e vediamo..grazie dei consigli..a presto! |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2011 : 13:41:07
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| la banda "bianca" del centro, probabilmente, è una over espressione!! Hai bruciato la lastra. Prima di ogni altra cosa prova semplicemente a tenere la lastra sulla membrana per molto meno tempo, suggerirei anche una decina di secondi. Ma, se così fosse, tu al buio dopo ECL dovresti vedere le bande di actina a occhio nudo... |
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ste7fano
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2011 : 17:10:10
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| @kristanko Si al buoi la banda si vede benissimo..e visto che il segnale è così potente poggiamo la lastra sulla membrana senza nemmeno chiudere la cassetta raggi x! oggi l'actina è uscita bene..il problema ora è per l'srb1 che ci ha dato una lastra completamente nera..sembrerebbe background ma non ne siamo sicuri.. la diluizione che abbiamo fatto è 1:3000 sia per il primario che per il secondario in milk al 5%! |
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kristanko
Utente Junior
Città: Bologna
123 Messaggi |
Inserito il - 06 aprile 2011 : 15:35:35
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| qual è il secondario? |
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ste7fano
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2011 : 12:07:50
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| E' un anti-rabbit amersham ..sembra che non dia problemi con gli altri anticorpi..oggi abbiamo di nuovo la rivelazione di un srb1 su membrana strippata e diluito con BSA 3%..abbiamo pensato potesse aver problemi con le proteine del milk.. |
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_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2011 : 12:50:28
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| Ma questi anticorpi e' la prima volta che li usi? |
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ste7fano
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 10 aprile 2011 : 22:46:29
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| Si l'srb 1 è nuovo! L'actina no..ma ha sempre funzionato! |
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Western Blotting actina
Didattica e Relazioni
