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chiapas84
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14 Messaggi
Inserito il - 06 aprile 2011 : 22:33:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chiapas84 Invia a chiapas84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, mi trovo a lavorare con cDna sul quale devo effettuare delle PCR per amplificare completamente una sequenza tradotta, dalla Met sino al codone stop modificato (Il frammento sarà clonato in un vettore con His-tag al 5'). Nel mio caso purtroppo la scelta dei primer è obbligata, e non sempre è possibile scegliere primer ottimali.Io mi trovo delle coppie di primer che tendono a dimerizzare. Voi come risolvete questo problema? Su che parametri della reazione?

Cordiali saluti, Antonio.

chiapas84
Nuovo Arrivato



14 Messaggi
Inserito il - 09 maggio 2011 : 18:28:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chiapas84 Invia a chiapas84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1724 Messaggi
Inserito il - 09 maggio 2011 : 20:53:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Come fai a dire che i primer dimerizzano?
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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biohazard0603
Nuovo Arrivato



6 Messaggi
Inserito il - 09 maggio 2011 : 21:15:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biohazard0603 Invia a biohazard0603 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
a meno che non siano sequenze palindromiche come fanno a polimerizzare?
comunque crebdo che dovresti scegliere un pH tale che esso sia abbastanza basico da denaturare i dimeri rna-rna ma non tanto da denaturare dna-rna
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chiapas84
Nuovo Arrivato



14 Messaggi
Inserito il - 09 maggio 2011 : 21:29:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chiapas84 Invia a chiapas84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Self-annealing: Warning: There are more than 3 self-annealing bases in a row;
----------------------------------------------------ggatccatggttaattatttctctt
----------------------------------------------------||||||
---------------------------------ttctctttattaattggtacctagg

Ovviamente è un programma per il disegno e il testing di primer che mi dà il warning. Purtroppo la formattazione del post mi sposta le sequenze, però è facile vedere che ci sono 6 basi complementari al 5' di un primer e al 3' dell'altro.
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1724 Messaggi
Inserito il - 09 maggio 2011 : 22:31:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vero, ma usando un'opportuna temperatura di melting credo che il problema non ti dia fastidio!
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi
Inserito il - 10 maggio 2011 : 00:03:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quoto quello che ha detto Domi, alla T di annealing che avrai nn credo che un appaiamento di sole 6 basi possa interferire con quello delle regioni complementari primer-DNA (che sono piu' estese)
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chiapas84
Nuovo Arrivato



14 Messaggi
Inserito il - 10 maggio 2011 : 01:35:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chiapas84 Invia a chiapas84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille ragazzi!!!
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