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matteo991
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 10:32:37

ragazzi qualcuno sa dirmi la differenza tra questi due procedimenti in maniera chiara ed esaustiva? molte grazie a chi risponder� :)

biocandy
Utente Junior

370 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 10:57:22

il concetto alla base � lo stesso:amplificare un frammento di DNA! La PCR tradizionale per� � una metodica qualitativa (alla fine della PCR fai un elettroforesi su cui carichi il tuo amplificato e se vedi la banda sai che l'amplificazione c'� stata) mentre la RealTime � una metodica quantitativa!Riesci a risalire anche al numero di copie iniziali del tuo frammento e alla fine delle reazione visualizzi proprio il plot di amplificazione (perch� si usano dei sistemi di rilevamento tipo SybrGreen, sonde TaqMan ecc)
inoltre guarda qui per alcuni dettagli
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf

se hai bisogno di ulteriori chiarimenti chiedi pure

matteo991
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 11:55:40

non ho ben capito il metodo con la sonda taqman come agisce :(

biocandy
Utente Junior

370 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 12:09:00

per fare una PCR hai bisogno di due primer, il forward e il reverse..questi si appaiano agli estremi del frammento che devi amplificare. Nel metodo TaqMan si disegna una sonda che si appaia nella regione compresa fra i due primer; questa sonda porta al 5' un colorante fluorescente detto reporter e al 3' un colorante spegnitore detto quencher. Prima dell'amplificazione, la fluorescenza emessa dal reporter viene completamente assorbita dal quencher, ma quando la DNA polimerasi, amplificando, arriva nei pressi della sonda la degrada (ha infatti un'attivit� esonucleasica 5'-3') e quindi il reporter, essendo stato allontanato fisicamente dal quencher, pu� emettere la fluorescenza che verr� rilevata dal detector. Questa fluorescenza aumenta in maniera direttamente proporzionale alla quantit� di DNA amplificato nella reazione e questo si pu� visulizzare come amplification plot tramite opportuni software forniti con lo strumento.

Immagine:

7,08�KB

matteo991
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 15:03:42

molto molto gentile !! grazie mille

biocandy
Utente Junior

370 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2011 : 15:05:56

Di nulla!spero di esserti stata utile!

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