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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
 Inserito il - 10 novembre 2006 : 12:03:33
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Salve ragazzi, il prof del mio lab mi ha chiesto di eseguire un saggio MTT su mitocondri di CaCo2 cell line. Io ho fatto una med-line per questa tecnica, ma tutto quello che ho trovato è una descrizione sommaria della tecnica.
chi ne sa qualcosa in più?
Da quello che ho capito io, devo piastrare le cellule, stimolarle, aspirare il mezzo e incubarle (per quanto tempo???) con MTT (sciolto in cosa e a quale concentrazione?)per un'ora.
Poi aspiro l'MTT e incubo i pozzetti con DMSO(quanto e per quanto tempo?). Poi raccolgo il DMSO, lo passo in cuvetta e faccio la lettura allo spettrofotometro. Ma, dal momento che ho l'assorbanza dei campioni, qual è il riferimento? cioè, a cosa paragono la lettura dei miei campioni?
Grazie a chi mi darà una mano.
Smack
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...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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plof
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 10 novembre 2006 : 16:44:54
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grazie, sia per la risposta che per il link.
Avrei ancora una domanda:
non so bene in che termini porla, faccio un esempio così spero di essere più chiara:quando quantizzo le prt, uso come riferimento la BSA, cioè, in pratica faccio il rapporto della lettura del campione con la lettura della BSA a concentrazione nota. Nel caso dell'MTT test, invece, il rapporto va fatto tra la lettura del trattato e la lettura del non trattato? e in questo caso, la retta di taratura come si costruisce?
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stef
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
2 Messaggi |
 Inserito il - 11 novembre 2006 : 16:02:19
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Ciao Iside
io devo provare adesso a fare un saggio MTT sulle mie cellule. Mi hanno dato un protocollo in cui si dice che come bianco si usano pozzetti trattati allo stesso modo dei campioni ma senza cellule (medium, MTT, e SDS). I bianchi vengono letti contro aria.
Se lo spettrofotometro te lo fa fare puoi sottrarre automaticamente alle letture dei campioni la lettura dei bianchi, altrimenti devi fare la lettura dei bianchi e poi sottrarla manualmente a quella dei campioni.
Appena ci provo anch'io magari ti so spiegare meglio o magari mi troverò a chiedere... AIUTO!!!
Se hai ancora bisogno dimmelo e ti allego il protocollo che ho io.
ciao
Ste |
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vale.v.
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 30 giugno 2010 : 11:20:00
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| hola!!io avrei un problema...a distanza di 1 settimana ho fatto lo stesso saggio mtt, sulle stesse cells, stessi trattamenti...ma la settimana scorsa: tutti i pozzetti mi son diventati viola scuro, e questa settimana tutto giallissimo!!..ufufuf...le concentrazioni so per certo che son giuste, perche è solo per una riconferma del dato..ufufuf...a qualcuno è mai successo?? |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2010 : 18:58:26
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| ? le cellule diventano per forza blu-viola, è il colore dei cristalli di formazano che si formano nelle cellule metabolicamente attive..se è tutto giallo (suppongo io il giallo dato dalla soluzione di MTT) sono tutte morte o non attive metabolicamente, altre spiegazioni non ne avrei. Ma anche il controllo non trattato..? |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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support_biomatica_it
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 27 settembre 2010 : 20:46:00
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Salve per la tempistica questo protocollo si è dimostrato molto efficace nei nostri laboratori
DESCRIPTION:
1. Make 2ml or more of MTT solution per 96 well plate at 5mg/ml in PBS. Do not make a stock as MTT in solution is not stable long-term.
2. Add 20ul MTT solution to each well. Place on a shaking table, 150rpm for 5 minutes, to thoroughly mix the MTT into the media.
3. Incubate (37C, 5% CO2) for 1-5 hours to allow the MTT to be metabolized.
4. Dump off the media. (dry plate on paper towels to remove residue if necessary.
5. Resuspend formazan (MTT metabolic product) in 200ul DMSO. Place on a shaking table, 150rpm for 5 minutes, to thoroughly mix the formazan into the solvent.
6. Read optical density at 560nm and subtract background at 670nm. Optical density should be directly correlated with cell quantity.
ADD ENDUM NOTES:
1. Do not make a stock as MTT in solution is not stable long-term.
2. It’s advantageous to do in 96 well plates using 500-10,000 cells in 200ul media per well
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Get product support & check for updated protocols on http://win.biomatica.it/EShop/Boards/ |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2010 : 13:01:27
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ciao
io faccio maree di MTT con il kit Roche...pratic piastro 20.000cell\well in 100ul di terreno e poi le tratto a diverse concentrazioni per es per 24-48h. dopo il trattamento aggiungo a ogni pozzetto 10ul di MTT e lascio 4h a 37°. dopo le 4 ore leggo l'A a 540nm. per elaborare i dati il mio controllo sn le sole cellule non trattate, su cui normalizzo i valori di lettura.
Baci |
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Daria85
Utente
678 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2010 : 13:02:28
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dimenticavo!dopo le 4h cn MTT devo solubilizzare con 100ul di soluzione solubilizzante!la piastra va poi rimessa in incub e letta il giorno dopo!
Baci |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 12:29:23
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grazie a tutti ma...il mio post risale a quattro anni fa  |
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Saggio MTT
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