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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
 Inserito il - 05 agosto 2011 : 12:58:06
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Ho trovatogià una spiegazione nel forum però volevo essere sicura di aver capito..ora vi posto una parte
Citazione:
Innanzitutto la luce viene generata da un laser. I laser usati per la microscopia confocale emettono una lunghezza d'onda fissa quindi non hai bisogno di filtri di eccitazione. Hai ancora una volta il tuo specchio dicroico che fa passare la luce, nel disegno verde, e l'obiettivo che la focalizza sul campione. Il campione viene nuovamente eccitato ed emette luce (in rosso) sul piano focale e da altri piani. E qui arriva il trucco! La luce torna allo specchio dicroico, viene fatta passare e poi passa da un "pinhole", un buchino molto piccolo la cui dimensione può essere regolata dall'osservatore che fa passare SOLO la luce dal piano focale. (devi seguire un po' le frecce nel disegno).
A questo punto arriva al detector che nel caso del confocale è generalmente un fotomoltiplicatore (PMT) che serve per amplificare il segnale, in quanto gli arriva molta meno luce che in un microscopio convenzionale.
Vantaggi del confocale:
1) il laser viene focalizzato dall'obiettivo sul campione, quindi arriva in un solo punto del campione. Quindi, nonostante tu abbia comunque bleaching sull'asse z, cioè nella profondità del campione, non avrai bleaching nelle zone che non stai guardando. D'altra parte la luce del laser è generalmente più forte (anche se può essere modulata) quindi nella zona dove stai osservando il bleaching è molto più forte.
Non sono sicura di aver capito bene questa parte.Forse perchè mi servirebbe un disegno.Consideriamo un campione..le sezioni vengono fatte in senso verticale vero?quindi il laser colpisce una piano verticale del campione che è il nostro piano focale.Non avremo fluorescenza che deriva dalle zone laterali perchè anche quel poco di fluorescneza che ci potrebbe stare viene poi bloccata dal pinhole ..giusto? ( nel microscopio a fluorescenza invece la luce colpisce tutto il campione non uno solo punto?)
Citazione:
Però ci resta la fluorescenza che deriva dalle zone superiori ed inferiori..
ecco non capisco cosa intende..si riferisce alla fluorescenza che deriva da tutto il nostro piano focale ( verticale)?
AGGIUNGO ANCORA un 'alta domanda..riguardo il confocole a due fotoni..
Citazione:
in questo caso possiamo evitare di utilizzare il pinhole perchè la densità di fotoni sarà elevata solo nel piano di fuoco ( nel nostro caso verticale)e sarà molto bassa la probabilità che due fotoni fotoni a bassa energia si incontrino nel piano laterale fuori fuoco.
c'è ancora un altro dubbio..questa frase nn mi è molto chiara
Citazione:
il microscopio a 2 fotoni crea l'immagine punto per punto come il confocale), ma solo dal piano focale
cioè considerando un piano focale ,il microscopio a due fotoni si fa varie sezioni solo di quel piano focale? e come fa? o.O
scusatemi ho le idee moolto confuse
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 14:50:07
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Allora, andiamo punto per punto:
Citazione:
Non sono sicura di aver capito bene questa parte.Forse perchè mi servirebbe un disegno.Consideriamo un campione..le sezioni vengono fatte in senso verticale vero?quindi il laser colpisce una piano verticale del campione che è il nostro piano focale.Non avremo fluorescenza che deriva dalle zone laterali perchè anche quel poco di fluorescneza che ci potrebbe stare viene poi bloccata dal pinhole ..giusto? ( nel microscopio a fluorescenza invece la luce colpisce tutto il campione non uno solo punto?)
Disegno:
Il tuo ragionamento è quasi giusto... basta girarlo di 90 gradi!
Le sezioni ottiche (o piani focali) sono orizzontali.
La fluorescenza che viene bloccata dal pinhole è quella dei piani più in alto o più in basso
Citazione:
AGGIUNGO ANCORA un 'alta domanda..riguardo il confocole a due fotoni..
Nota che si chiama "microscopio a due fotoni" non "confocale a due fotoni".
Citazione:
cioè considerando un piano focale ,il microscopio a due fotoni si fa varie sezioni solo di quel piano focale? e come fa? o.O
semplicemente il laser eccita i fluorofori solo sul piano focale in quanto solo sul piano focale la densità di fotoni è sufficientemente alta per ottenere un eccitazione a due fotoni. Quindi TUTTA la luce che arriva al detector (es. camera o PMT) arriva dal piano focale. Indi, non c'è bisogno di pinhole. |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 14:57:22
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Continuo a guardare il disegno ma non capisco perchè i piani sono orizzontali..la luce giunge dall'alto..e poi fa vedere che diventa orizzontale  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 15:33:04
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Perchè ti manca probabilmente il fatto che il confocale acquisisce l'immagine punto per punto. Il laser si sposta nel piano x-y (orizzontale) grazie ad uno *scanning mirror* e prende così un immagine del piano orizzontale.
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 15:38:26
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Provo a ricapitolare..penso di aver trovato ancora qualcosa di utile in rete.."viene utilizzato un pinhole per la luce di
eccitamento, in modo da illuminare solo una porzione microscopica del campione. Per ottenere la rappresentazione non di una porzione microscopica del campione ma di un intero piano, si muove il fascio di luce lungo il campione di punto in punto, in modo che tutto il
piano situato alla profondità voluta venga illuminata dal fascio di luce secondo una precisa sequenza.Questo processo viene detto scansione.Spostando lungo l’asse verticale il campione dopo ogni scansione, è possibile eseguire una serie di scansioni successive corrispondenti ai piani focali via via più profondi all’interno del
campione. Queste scansioni prendono il nome di sezioni ottiche e la loro sovrapposizione ordinata, eseguita
via softwere, consente di ricostruire un’immagine complessiva dell’intero volume scandito, in cui
tutti i piani sono contemporaneamente a fuoco"--> http://www-3.unipv.it/webtanzi/13_Microscopia%20confocale.pdf
Quindi se ho capito il campione viene spostato in senso orizzontale per avere la scansione della sezione ottica e inoltre viene spostato in senso verticale in modo tale che il raggio laser giunga ogni volta ad una profondità diversa.Chiedo conferma.
Anche se la luce laser colpisce un solo piano focale ,avremo fenomeni di rifrazione per cui ci sarà una minima fluorescenza che deriva dai piani al di sopra e al di sotto del piano focale,essa viene poi bloccata dal pinhole .. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 16:03:06
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Citazione:
Quindi se ho capito il campione viene spostato in senso orizzontale per avere la scansione della sezione ottica e inoltre viene spostato in senso verticale in modo tale che il raggio laser giunga ogni volta ad una profondità diversa.Chiedo conferma.
E' il laser che si sposta sul piano orizzontale, non il campione, ma vabbè il risultato è lo stesso.
Citazione:
Anche se la luce laser colpisce un solo piano focale ,avremo fenomeni di rifrazione per cui ci sarà una minima fluorescenza che deriva dai piani al di sopra e al di sotto del piano focale,essa viene poi bloccata dal pinhole ..
No. La luce del laser attraversa tutto il campione quindi con un confocale hai sempre della fluorescenza che viene da altri piani focali. Con un 2 fotoni invece solo il piano focale viene eccitato (la luce passa comunque nel resto del campione, ma ha energia troppo bassa per eccitare i fluorofori) e quindi hai solo fluorescenza dovuta ai fluorofori nel piano focale. |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 16:26:41
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| OK ho sempre fluorescenza che deriva da altri piani al di sopra e al di sotto del piano focale ma sarà minore perchè le caratteristiche della luce laser assicurano una minore quantità di fenomeni di diffrazione e aberrazione della luce.Confermi? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 20:07:38
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Sì, in generale sì, ma poi dipende tutto dalle caratteristiche del campione che stai guardando ovviamente.
ok ti ringrazio tantissimo..anche per la tempestività!ne approfitto ancora un po' ..come mai ultimamente il forum dà problemi e nn mi fa postare nuove discussioni?volevo chiedere della criopreservazione nel forum biotecnologie xk qui nessuno mi ha risposto :((
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 20:23:50
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Si esce così:
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Either BOF or EOF is True, or the current record has been deleted. Requested operation requires a current record.
/forum/post.asp, line 554 |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 04:17:02
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Ciao Federica,
come detto anche da chick, grazie per la segnalazione.
Purtroppo non riesco a controllare il sistema prima di lunedì.
Quindi ti mando un messaggio privato appena lo sistemo se dovessi avere ulteriori informazioni.
Grazie! |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 09:22:43
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Citazione:
Messaggio inserito da atreliu
Ciao Federica,
come detto anche da chick, grazie per la segnalazione.
Purtroppo non riesco a controllare il sistema prima di lunedì.
Quindi ti mando un messaggio privato appena lo sistemo se dovessi avere ulteriori informazioni.
Grazie!
Grazie a voi ^__^ |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 18:08:21
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Lo faccio sapere all'amministratore, grazie della segnalazione!
Eccommi di nuovo qui mi è venuto un altro dubbio..tu dici che nel microscopio a fluorescenza il campione viene illuminato tutto..ma nn mi trovo perchè esistono dei sistemi di regolazione ( i diaframmi) per decidere la parte di campione che deve essere osservata e quindi che deve essere colpita dalla luce..no?e quindi avremmo solo la fluorescenza che deriva dai piani al di sopra e al di sotto del piano focale
( questa frase non mi sembra tanto giusto però o.O perchè il piano focale è unico nel caso del microscopio a fluorescenza quindi al massimo direi che si ha una fluorescenza diffusa nello spessore del campione che porta ad un'immagine poco nitida) |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 18:59:16
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Sì, scusa, in effetti la frase era un po' ambigua... intendevo viene illuminato tutto in profondità, non in orizzontale.
Ad ogni modo in un confocale non hai bisogno di diaframmi, perchè il laser è "puntiforme", quindi illumina una zona molto molto ristretta del campione (e poi viene mosso nel piano x-y per poter prendere un'immagine di un piano) |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2011 : 16:30:33
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Sì, scusa, in effetti la frase era un po' ambigua... intendevo viene illuminato tutto in profondità, non in orizzontale.
Ad ogni modo in un confocale non hai bisogno di diaframmi, perchè il laser è "puntiforme", quindi illumina una zona molto molto ristretta del campione (e poi viene mosso nel piano x-y per poter prendere un'immagine di un piano)
fiuuu.ok grazie |
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Confocale Laser
Didattica e Relazioni
