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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 25 agosto 2011 : 17:22:29
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Ciao ragazzi 
dovrò mettere a punto un saggio di fosfatasi in vitro a freddo (quindi, senza radioattivo).
Devo saggiare l'attività di una fosfatasi su un substrato noto, in presenza o meno di una proteina che, secondo me, potrebbe fungere da coattivatore.
Ho acquistato la subunità catalitica della fosfatasi purificata e devo scegliere il buffer a cui aggiungerò il substrato e il cofattore "isolati" per immunoprecipitazione. In tutto ciò... ho un dubbio atroce... e qui mi venite in soccorso voi spero 
Leggendo in vari articoli, kit etc. ci sono infiniti buffer in cui far avvenire questa reazione... anche molto diversi tra loro...
Voi sapete quali sono le componenti fondamentali per far funzionare una fosfatasi (tra l'altro, la mia fosfatasi è PP2A, protein fosfatasi 2A).
Per ora ho provato un buffer molto semplice, con CaCl2 e tris Hcl. Purtroppo non mi sembra che la fosfatasi abbia defosforilato il substrato, ma potrebbe essere dovuto al fatto che ho incubato poco l'enzima con il substrato (solo 10min) oppure al buffer... non so.
Se ne sapete di più, illuminatemi :)
Grazie
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Ascoltami con gli occhi... |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 25 agosto 2011 : 20:18:57
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Citazione:
Messaggio inserito da Gst
Ciao ragazzi
dovrò mettere a punto un saggio di fosfatasi in vitro a freddo (quindi, senza radioattivo).
Devo saggiare l'attività di una fosfatasi su un substrato noto, in presenza o meno di una proteina che, secondo me, potrebbe fungere da coattivatore.
Ho acquistato la subunità catalitica della fosfatasi purificata e devo scegliere il buffer a cui aggiungerò il substrato e il cofattore "isolati" per immunoprecipitazione. In tutto ciò... ho un dubbio atroce... e qui mi venite in soccorso voi spero
Leggendo in vari articoli, kit etc. ci sono infiniti buffer in cui far avvenire questa reazione... anche molto diversi tra loro...
Voi sapete quali sono le componenti fondamentali per far funzionare una fosfatasi (tra l'altro, la mia fosfatasi è PP2A, protein fosfatasi 2A).
Per ora ho provato un buffer molto semplice, con CaCl2 e tris Hcl. Purtroppo non mi sembra che la fosfatasi abbia defosforilato il substrato, ma potrebbe essere dovuto al fatto che ho incubato poco l'enzima con il substrato (solo 10min) oppure al buffer... non so.
Se ne sapete di più, illuminatemi :)
Grazie
Allora innanzitutto dovresti leggerti le istruzioni allegate all'enzima che hai acquistato (di solito includono anche riferimenti bbliografici).
Dovresti fornire anche qualche info più specifica, pe es fosfatasi è acida o alcalina?
io eseguo il dosaggio della ALP nel siero quotidianamente in laboratorio
ecco la reazione catalizzata dalla ALP e il p-nitrophenol è colorato leggo l'assorbanaza a 405nm
p-nitrophenylphosphate + H2O #63719;#63719;#63719;#63719;#63719;#63719;#8594; p-nitrophenol + HPO4-2
incollo dal datasheeet del kit
ALP R1 containing: 2-amino-2-methylpropanol (AMP) 471 mmol/L,
Zinc++ 1.44 mmol/L, Magnesium++ 2.88 mmol/L, HEDTA 2.88 mmol/L.
ALP Substrate containing: p-nitrophenylphosphate 150 mmol/L.
ovviamente tutti gli elementi della reazione devono essere in eccesso ad eccezione della fosfatasi che deve essere il fattore limitante
Good luck |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2011 : 17:50:20
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Ciao Martin.diagnostica
condivido il consiglio di leggere il datasheet! Ed infatti lo avevo già fatto! Purtroppo sul datasheet dicono solo che è una fosfatasi dipendente da cationi divalenti. Per quanto riguarda le referenze, sono una review, un paper dove usano la fosftaasi NON in un saggio di fosfatasi, e negli altri fanno un saggio di fosfatasi con radioattivo, mentre io devo farlo a freddo. Diciamo che forse il datasheet non è il massimo in questo caso!
Detto ciò... la domanda che avevo posto rimane
Grazie comunque!
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 26 agosto 2011 : 18:03:12
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umh ma nel buffer del mio kit infatti sono presenti zn2+ e mg2+ puoi provare quel buffer. Per rispondere meglio alla tua domanda dovresti almeno dirci il nome esatto e la casa produttrice della tua fosfatasi.Puoi vedere se in letteratura qualcuno ha eseguito dei dosaggi utilizzando questo prodotto.
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