PCR CON PLASMIDI

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sara86
Nuovo Arrivato

Prov.: Como
Citt�: cantu

13 Messaggi

Inserito il - 12 novembre 2006 : 23:00:03

Esperimento di laboratorio di mutagenesi con metodo della pcr.

Abbiamo inserito un plasmide batterico da mutare nel termociclatore, con oligo mutati, NTP etc etc. Alla fine abbiamo ottenuto la nostra pcr, e quindi il nostro dna mutato.

domanda numero 1: ma il dna che ho mutato non si pu� richiudere e formare un plasmide, vero? in teoria no, dovrebbe legare un 3' ad un 5', il che non funziona.

dopo di che abbiamo purificato il dna e lo abbiamo digerito con DPNI, in modo tale da togliere i plasmidi wild type (DPN digerisce i nucleotidi metilati, e noi non abbiamo inserito nessun CTP metilato [non siamo masochisti]).

Poi abbiamo trasformato i batteri con questo dna. e l'esperimento non � venuto per nulla. Abbiamo rifatto tutto 3 volte, la prima volta era venuta una patina di batteri a causa di una conc molto bassa di kanamicina [e quindi i batteri sono cresciuti in quantit� industriale], la seconda volta � venuto solo a qualcuno, e la terza volta non � venuto a nessuno, le petri erano VUOTE. Dalle piastre petri trasformate la seconda volta abbiamo preso delle colonie e abbiamo inoculato l'LB, il giorno dopo alcune erano cresciute e altre no.

ORA: dove sta il problema? io pensavo che non si fosse richiuso il plasmide, ma in realt� se qualcuno � riuscito a fare crescere qualcosa nella falcon con l'LB la seconda volta (e nella falcon c'era l'antibiotico), vuol dire che il plasmide funzionava (se qualcuno mi spiega come mi fa un piacere).

Le domande sono due:
1.secondo voi perch� mai ad alcuni non � venuto l'esperimento e ad altri s�, pur avendo le stesse mutazioni?
2. come si � potuto richiudere quel plasmide?!?!(non abbiamo eseguito nessunissimo tipo di ligazione!)

grazie mille, so di non essere stata chiarissima, spero che qualcuno capisca!

a tutti