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MariaR
Nuovo Arrivato
Prov.: BN
Città: Benevento
50 Messaggi |
 Inserito il - 10 febbraio 2012 : 22:24:07
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Sto facendo la domanda più stupida del mondo ma questo forum è fatto per risolvere dubbi e arricchire la nostra conoscenza, quindi mi faccio avanti.
Per essere breve posso dire che sto controllando per Wb l'espressione di una proteina che ho over-espresso in cellule Hela.
Una è wild type e sta nel nucleo, l'altra ha delle sostituzioni amminoacidiche a livello dell'NLS in modo che rimane confinata nel citoplasma. Queste cellule dopo la trasfezione, la selezione sono state raccolte, lisate per estrarre le proteine; le proteine quantizzate e corse e arriviamo al punto.
poichè hanno un tag-HA identifico entrambe con lo stesso anticorpo ma corrono a PM simili. Ho trovato che le sostituzioni amminoacidiche possono provocare variazioni nella carica superficiale della proteina. Le sostituzioni sono del tipo: Lys-Ala e Arg-Ala
E infatti mi trovo:
L'arginina è un amminoacido polare (con catena laterale idrofilica) basico, lo stesso la lisina, mentre l'alanina è un aa non polare.
Se le proteine mediante SDS-PAGE vengono separate per diverso PM, in quanto l'sds conferisce una carica negativa alla proteina, come faccio a spiegare la corsa simile tra le due?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 22:46:42
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In realtà è il risultato atteso, salvo che tu non abbia cambiato MOLTI residui da carichi a non-polari o viceversa oppure che la proteina non sia davvero piccolissima, più che altro un piccolo peptide. Devi infatti considerare che dovresti avere 2,5 molecole di SDS per aminoacido, dunque l'effetto di poche cariche in meno od in più (quelle relative alle posizioni mutagenizzate) viene letteralmente sovrastato dall'SDS. Come togliere una o due pagine dall'Alberts (un librone di biologia molecolare e cellulare sopra le 1500 pagine credo) e poi pesarlo nei due casi sperando di vedere significative variazioni di peso.
Ne consegue che migrazione avviene alla medesima velocità nello stesso gel. |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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MariaR
Nuovo Arrivato
Prov.: BN
Città: Benevento
50 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 23:01:20
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Ok. Nel mio caso la proteina è di 27kDa e sono 4 sostituzioni con alanine al posto di arginine e lisine...quindi forse vale la seconda ipotesi?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 23:15:25
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A me è stato suggerito questo calcolo: peso molecolare proteina/ peso molecolare medio di un aminoacido.
Nel tuo caso, dunque: (27000 Da) / (110 Da/a) = 6600 aa. Ora, se la media di 2,5 molecole di SDS, osssia 2,5 cariche negative acquisite per ogni aminoacido, capisci che la variazione di carica a cui va incontro la forma mutata è risibile (grossolanamente meno dello 0,05%).
In questo caso, dunque, per me è normalissima la tua situazione, non preoccuparti. Un gel così non ti permetterà mai di vedere cambiament simili. Fosse un gel in condizioni native, allora forse le cose cambierebbero, FORSE. Ma non ho abbastanza esperienza, i casi sono molteplici e soprattutto non è proprio il tuo caso.
Buon weekend
PS:
L'influenza della carica PROPRIA della proteina si fa sentire in casi in cui la proteina ha una forte carica propria, come per esempio gli istoni, che hanno una carica positiva non trascurabile che fa si che migrino più lentamente in gel. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 23:25:57
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Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
A me è stato suggerito questo calcolo: peso molecolare proteina/ peso molecolare medio di un aminoacido.
Edit: non so che casino ho fatto con la calcolatrice di windows, in realtà si tratterebbe di circq 245 aa.
I miei calcoli vanno un po' rivisti, adesso non sono più sicuro se valga quanto scritto sopra.
Quale delle due migra di più?
PS: il messaggio un po' enigmatico fa riferimento ad un pm ricevuto da MariaR che spero riporti in pubblica perché altrimenti sembro contraddirmi ancora di più di quanto già non sia... |
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MariaR
Nuovo Arrivato
Prov.: BN
Città: Benevento
50 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2012 : 23:45:56
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| Hai ragione e infatti la tua risposta mi ha un pò confuso. La proteina ha un PM di 27kDa, quindi la wild type migra intorno a 27kDa, mentre la mutante (con 4 sostituzioni amminoacidiche) migra un pò più altra, circa 30kDa. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2012 : 12:06:46
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MariaR innanzitutto ti pregherei se inizi una discussione sul forum di continuarla sul forum, in modo che tutta la community sia coinvolta e chiunque ti possa dare delle risposte. Continuare via PM a meno che ci siano motivazioni private non ha alcun senso e tra l'altro e controproducente perchè chi legge non può più seguire il discorso e fa più fatica ad aiutarti.
Detto questo e visto che mi sono persa qualche pezzo della discussione e gli ultimi post non mi ho ben compresi, quello che posso dirti è:
- come diceva 0barra1 visto che c'è l'SDS la carica degli AA non influenza più di tanto la mobilità elettroforetica
- quello che potrebbe cambiare è il peso molecolare della tua proteina, ma varierebbe di poco e quindi dubito fortemente che tu possa vedere delle differenze
Comunque sia ti consiglio, se non l'hai fatto di andare a vedere quel'è il PM calcoato delle due proteine, per farlo basta un qualsiasi calcolatore di PM (vai in google cerchi "Protein MW calculator" e ne trovi quanti ne vuoi)
Ora, non sapendo la tua sequenza e sapendo che hai solo sostituito 4 alanine con Arginine e Lisine ho fatto un conto molto a spanne:
4 Ala pesano circa 0,3KDa
4 Arg o 4 Lys pesano circa 0,67KDa
la differenza sarebbe quindi circa 0,37KDa che è veramente poco per essere vista in SDS-PAGE.
Io delle differenze di 1KDa le vedo in SDS-PAGE, ma così poco credo che sia praticamente impossibile.
N.B. Ma gli ultimi valori che hai scritto, 27KDa e 30KDa da dove saltano fuori? Hai fatto qualche calcolo? |
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MariaR
Nuovo Arrivato
Prov.: BN
Città: Benevento
50 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2012 : 15:27:46
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Il messaggio privato non l'ho mandato per motivazioni personali ma perchè avevo perso un pomeriggio su questa cosa e vedendo Obarra1 in linea pensavo che mandando un messaggio privato potesse leggere la risposta che gli avevo nel frattempo mandato sul forum (la risp pubblica). Forse non ci ho fatto caso ma avrò dato informazioni in più nel messaggio privato. Cmq acccetto la ripresa :)
Detto questo, quei PM molecolari saltano fuori dalle lastre. Forse sono stata io a non spiegarmi bene. Mediante western verifico l'espressione. Quindi il western degli estratti proteici di Hela trasfettate con il costrutto wt-HA, mostra che la proteina corre intorno ai 27kDa. Mentre le Hela trasfettate con il costrutto 4A-HA mostrano che la proteina corre poco più sopra, intorno a 30kDa. Ora dinanzi alla possibile domanda di un prof o per coltura personale, volevo sapere con estrema chiarezza la motivazione dietro questa leggera differenza di peso.
Avendo come principio di base che non vi è la rimozione di un dominio e per questo motivo non mi aspetto un diverso PM della proteina, e che le proteine non sono separate in base alla loro carica ma in base al loro PM. Poichè il mio supervisione mi ha accennato il discorso delle cariche, volevo capirlo fino in fondo.
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Sostituz. aa si traducono in differente corsa elettroforetic
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