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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
 Inserito il - 12 dicembre 2006 : 15:03:49
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Anche stavolta staminale..ha pasticciato in laboratorio!!!
Vi spiego:
Visto che le "cellule staminali"..aderiscono alla piastra molto lentamente..ho pensato di usare la laminina di mouse della BD Biosciences (non so se è permesso dirlo!) per rendere il substrato più gradevole!
ieri:
ho semplicemete messo 80 microlitri della soluzione madre (1.25 milligrammi per ml) in 2 ml di DMEM poi aliquotato 500 microL a pozzetto (4 di una piastra 6 well)
Lasciato 1 ora (in realtà anche di più) aT ambiente
Aspirato il materiale rimasto
Lasciato asciugare ancora un pò sotto cappa
Piastrato le cellule
Oggi:..Mi aspettavo di vedere un tappeto di cellule aderenti ed invece graaaande delusione....... HO VISTO LE CELLULE E HO NOTATO CHE NON HANNO ADERITO PIU' DI QUANTO FACESSERO IN ASSENZA DI LAMININA!!!
Se qualcuno di voi ha utilizzato la laminina può dirmi dove ho sbagliato ????????
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alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2006 : 17:35:18
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Ciao Ale!
Spero di esserti utile, nel mio laboratorio usiamo il coating di collagene e io non faccio altro che eseguire alla lettera quello che mi è stato detto quando ho messo piede in laboratorio!!! 
Comunque ho guardato sul sito della BD ma non ho trovato nessun data sheet della laminina, però ho trovato quello della Sigma che ti spiega come fare (è lo stesso che facciamo noi con il collagene!):
http://www.sigmaaldrich.com/sigma/product%20information%20sheet/L6274pis.pdf
1. devi calcolare l'area di quello che devi ricoprire
dal sito della Greiner ho trovato che l'area di un singolo well in una 6 well plate è 9,6 cm^2
http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/33_11/13336/
2. devi utilizzare 1-2ug di laminina per cm^2 quindi 9,6-19,2 ug
Se la tua soluzione madre è 1.25 mg/ml = 1.25 ug/ul ti servono 7.68-15.36 ul per ogni pozzetto da diliure in un volume il più piccolo possibile (non ho idea di quale sia il volume minimo per una 6well, io uso le flask, ma usa il volume minimo che ti permetta di coprire il fondo del pozzetto, a occhio i 500ul che hai usato mi sembra che vadano bene). Noi sciogliamo in Hank's o PBS.
3. A questo punto lasci per almeno 1h (meglio 2) a 37°C (non sono sicura che a T amb. basti 1 ora!)
4. Elimini il liquidi e sciacqui molto bene con PBS (3 volte).
Non so di preciso a cosa sia dovuto il tuo scarso risulato, la quantità di laminina che hai usato facendo i calcoli era di 25ug/pozzetto un po' in eccesso a quella consigliata (ma non so se questo possa creare problemi) e probabilmente non hai sciacquato i pozzetti prima di mettere le cellule.
Prova magari ad usare questo protocollo e vedi se va meglio, o magari qualcuno ha più esperienza e ti sa dare altri consigli!
Tieni presente che comunque "non sempre" le cellule crescono meglio su supporti con coating, a volte le differenze sono minime! 
Buona Fortuna  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2006 : 00:21:35
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Dipende un po' da che cellule staminali sono, non è detto che la laminina sia il substrato migliore.
Polilisina e collagene sono altre due opzioni, ma come ha detto GFPina a volte la plastica basta e avanza! |
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 13 dicembre 2006 : 11:21:10
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grazie ragazzi....lo so il data sheet volevo allegarlo ma non l'ho trovato neanche io ..su quello cartaceo che ho, comunque, consigliano da 1-10 microg per cm2!come al solito ..ho cercato di risparmiare e ne ho messi 2,6microgr per cm2! quindi la quantità è minore di quella media consigliata.
IL lavaggio non l'ho fatto...e questo potrebbe essere il vero problema!In realtà sul protocollo era scritto...ma poi me ne sono dimenticata...(che sbadata!!!) ! Probabilmente le cellule avranno aderito alla laminina che non si era attaccata alla piastra e quindi sono in sospensione anche se attaccate alla laminina!
Il punto ora è:
visto che sto preparando altre piastre(facendo attenzione ai lavaggi stavolta!!!) pensate che potrei ripiastrare le cellule IN SOSPENSIONE NELLA PIASTRA (SFIGATA) in una delle piastre che sto preparando ora??? Secondo me..non aderiranno comunque perchè la laminina a cui sono attaccate non è possibile farla aderire alla piastra! sbaglio??  |
alessandra |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 dicembre 2006 : 17:40:19
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Citazione:
Messaggio inserito da staminale
su quello cartaceo che ho, comunque, consigliano da 1-10 microg per cm2!come al solito ..ho cercato di risparmiare e ne ho messi 2,6microgr per cm2! quindi la quantità è minore di quella media consigliata.
Beh allora questo non è certo il problma!
Citazione:
Messaggio inserito da staminale
IL lavaggio non l'ho fatto...e questo potrebbe essere il vero problema!In realtà sul protocollo era scritto...ma poi me ne sono dimenticata...(che sbadata!!!)!
Eh... questo si!!! 
Citazione:
Messaggio inserito da staminale
Il punto ora è:
visto che sto preparando altre piastre(facendo attenzione ai lavaggi stavolta!!!) pensate che potrei ripiastrare le cellule IN SOSPENSIONE NELLA PIASTRA (SFIGATA) in una delle piastre che sto preparando ora??? Secondo me..non aderiranno comunque perchè la laminina a cui sono attaccate non è possibile farla aderire alla piastra! sbaglio??
Beh! Tanto per provare, se hai una piastra in più puoi farlo... ma non credo che si attaccheranno (o per lo mano se ne attacheranno pochissime!), in genere se non si attaccano subito è difficle che si attacchino!
Aspettiamo di sapere come è andata stavolta!
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staminale
Nuovo Arrivato
Città: Roma
28 Messaggi |
Inserito il - 19 dicembre 2006 : 14:27:29
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purtroppo la laminina non riesce ad agevolare l'adesione delle "mie" cellule!
In realtà però ho notato una cosa interessante...
considerate che io lavoro su cellule staminali CD133+ purificate da sangue di cordone ombelicale.Dopo averle isolate le tengo in terreno di metilcellulosa per 15 gg dopodichè le trasferisco su piastra aspetto che aderiscano (circa 7 gg) poi faccio dei trattamenti!
IL punto è che su piastre con coating di laminina ho provato a mettere sia le cellule che già erano state piastrate su una piastra senza laminina da circa 4 giorni e non avevano aderito sia cellule appena tolte dalla metilcellulosa (naturalmente dopo una serie di lavaggi per eliminare la metilcellulosa) e quindi subito piastrate su piastre con coating di laminina!
RISULTATO:
le prime non hanno proprio aderito al substrato...(ho provato 3 volte)
le seconde hanno aderito...(non moltissimo comunque!!)
la laminina si lega alle integrine vero?
Vi viene in mente qualcosa???? |
alessandra |
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djfrancioso
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Treviglio
1 Messaggi |
Inserito il - 22 ottobre 2007 : 11:00:39
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| Ma secondo voi sono migliori le piastre Greiner Bioscience o quelle della BD? |
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gigicarlessi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Brignano Gera d'Adda
3 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2008 : 14:56:58
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Ciao a tutti!
Anche io lavoro con le staminali, e pertanto devo utilizzare piastre (o flask) a cui precedentemente faccio un coating di laminina.
Le accortezze sono diverse.
Per esempio,
-l'aliquota di laminina la lascio scongelare lentamente per 3 ore circa a 4°C
- le piastre che mi servono le metto a 4°C per 15-20 minuti in modo da raffreddarle.
-io diluisco 50micrg di Laminina in 5-6 ml di terreno freddo (4°)
-utilizzo: 5ml per flask da 75cm2, 2ml per flask da 25cm2 0,7ml per pozzetto delle 6well e così via.
-dopo aver aggiunto il terreno con la laminina metto il tutto a 37°C per 4-5 ore.
-10-15 minuti prima lavorare con le cellule, aspiro tutto il terreno con la laminina e aggiungo medium a 37°C in abbondanza (per le T75 10ml, T25 5 ml etc etc)e rimetto tutto a 37°C
-Al momento opportuno, aspiro il medium di lavaggio e aggiungo il medium con le cellule.
Attenzione a non lasciar asciugare la superficie di laminina!!
Aspirate meglio che potete!! Le molecole di laminina che non polimerizzano sulla superficie ma che restano in sospensione, sono tossiche per le cellule"!!!
Buon lavoro, spero di esservi stati utili |
Carlessi Luigi INT UO1 |
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