dubbio allestimento exp teorico di PCR

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syd87
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24 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2012 : 22:01:51

Ciao ragazzi ho un dubbio, sto facendo degli esercizii teorici su clonaggio da aplificato a vettore di espressione. L'esercizio consiste nel mettere al 5' dei primer F e R una "coda" che contenga dei siti di restrizione per degli enzimi di restrizione che siano 0 cutter per l'inserto e 1 cutter per l'MCS del mio vettore di espressione.Fin qui tutto chiaro, il mio dubbio viene poi al momento dell'allestimento di una PCR, cio� se questi primer hanno queste cose che non si appaiano nei primi cicli di amplificazione come faccio a calcolarmi le Tm e Ta?

roberta.s
Utente Junior

Citt�: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 17 febbraio 2012 : 13:17:46

Io faccio una Gradient PCR, cosi' posso effettivamente sapere qual � la Ta ottimale per due primers del genere, che suppongo siano pi� lunghi del normale, e quindi con Tm piuttosto alte.
Comunque teoricamente la Tm (e di riflesso la Ta) la calcoli sul numero di basi che effettivamente si appaiano al DNA target.

PS: se ti dovessi trovare a disegnare primers del genere per un esperimento, all'estremit� dei nt che andranno a creare il sito di restrizione puoi aggiungere questa sequenza: cggccg. Cosi' eviti che il prodotto di PCR termini proprio con il sito di restrizione, il che incrementer� l'efficacia della reazione di taglio enzimatico.