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Silvy
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario
26 Messaggi |
 Inserito il - 19 dicembre 2006 : 23:08:37
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Ciao a tutti,
mi chiedevo se, nel calcolo della T melting di un primer 5' che contiene al 5' un sito di restrizione che inizialmente non si appaia alla sequenza target, devo tener conto anche delle basi dovute al sito, oppure no. Infatti, nei 2 diversi casi, ottengo due T melting un pò diverse e credo che questo potrebbe "incasinarmi" nella successiva decisione della T di annealing. Forse mi sono spiegata in modo un pò contorto...
ciao ciao
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2006 : 14:35:01
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Secondo me forse sarebbe meglio inserire un sito di taglio un po più internamente, magari dopo 6 - 8 basi dal 5'; in questo modo migliori la resa della digestione.
Per quel che concerne la Tm io di solito prendo in considerazione la Tm del primer con la mutazione e:
Se ho la Tm con 50 mM Na+ diminuisco tale valore di ca 0.2 - 0.3 gradi per ogni mismatch ( se ho da 2 a 3 basi di differenza diminuisco di almeno 1 grado)
Se invece ho la Tm con 1M tolgo 10° C di base + 1° per ogni mismatch.
Il mio è un sistema empirico che non ha fondamenti in nessun protocollo ma funziona.
Ciao |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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valeriamassa
Nuovo Arrivato
Prov.: Milano
Città: milano
64 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2006 : 18:28:47
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Ciao Anyra, potresti spiegarmi meglio la tua teoria sulla Tm? Cosa intendi con 50mM Na+? Sono molto curiosa a proposito, grazie mille ;)
Vale |
valeria |
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Silvy
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario
26 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2006 : 19:00:40
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Ciao Anyra, grazie per il suggerimento. Per il sito di restrizione al 5', in verità non ho messo basi aggiuntive poichè non mi serve per il taglio, ma per inserire il sito stesso in un vettore, in seguito ad un clonaggio blunt end. Già che ci sono, chiedo ancora alcune cose...
-quali programmi usate per il calcolo della T melting? Io uso IDT oligo analyzer 3.0 lasciando invariati i parametri preimpostati poichè non so bene cosa modificare...Inoltre, come faccio a valutare con questo programma la probabilità che si formino delle hairpin in un primer? Infatti, il programma associa alle hairpin che si formano dei valori di deltaG, ma non ho idea di quale sia la soglia sopra la quale debba "preoccuparmi" della formazione della hairpin.
Ancora grazie ad Anyra e a chi mi darà altri suggerimenti
Ciao |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2006 : 09:55:08
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Per Valeria:
Alcuni programmi ti chiedono la concentrazione salina diel sodio e del Magnesio che utilizzi in reazione e in base a quella ti calcolano un Tm che corrisponde alla t di anealing da usare in sede di reazione; maggiore è la concentrazione e più alta è la temperatura di dissociazione dei 2 filamenti.
Per Silvy
io uso diversi programmi:
Oligo per un primo approccio alla sequenza e per trovare dei candidati validi
con Bioedit poi faccio una piccola analisi di struttura controllo le Tm con la conc di Magnesio che utilizzo
altre volte uso il sito della sigma per fare varie analisi (ti da una predizione su un'eventuale struttura secondaria e se questa è forte oppure no
http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp
e infine (cosa sbagliatissima) vado con l'istinto e l'incoscienza.
La scelta dei primer non è una scienza esatta:
2 primer che sulla carta sono perfetti potrebbero non dare nessun prodotto, mentre una coppia imperfetta, con Tm diversissime, che fanno dimeri e con particolari strutture secondarie invece ti danno un prodotto ecezionale.
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Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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Silvy
Nuovo Arrivato
Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario
26 Messaggi |
Inserito il - 21 dicembre 2006 : 12:05:47
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Ciao Anyra,
grazie ancora per l'aiuto.
ciao a tutti e auguri di Buon Natale |
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T melting dei primers
Didattica e Relazioni
