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Citosina
Nuovo Arrivato
Città: Milano
73 Messaggi |
 Inserito il - 04 ottobre 2012 : 22:39:33
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Salve a tutti, ho da poco (tipo due settimane!) cominciato a tagliare al criostato e sto avendo qualche problema...pertanto chiedo aiuto a qualcuno di voi più esperto!
In pratica quando tento di tagliare al criostato ho i seguenti problemi sulle fettine:
1 - l'OCT tende a staccarsi dalla fettina appena dopo il taglio
2 - le fette si attaccano in maniera pessima ai superfrost plus tanto che a volte si formano bolle d'aria tra il vetrino e il tessuto e non riesco a farle andare via (ho provato anche a mettere del PBS sul vetrino prima di far aderire la fetta ma la situazione non cambia)
3 - le fette presentano una pessima morfologia (ci sono buchi)
In primis premetto che devo tagliare cervello di topo (fettine di 20 um) perfuso con PFA 4%. La perfusione è stata fatta in un altro lab quindi non so dirvi come sia stata eseguita nel dettaglio. I campioni successivati sono stati fissati O/N in PFA e in seguito si è fatta una postfixation in sucrose 30%: in teoria mi hanno detto che i cervelli sarebbero dovuti scendere (sink) sul fondo della falcon, il problema è che facevano molta fatica a scendere (del tipo che in una giornata intera non erano scesi quasi per niente). Infine i campioni sono stati congelati in ghiaccio secco mentre altri mi hanno detto che sarebbe stato meglio utilizzare dell'isopentano raffreddato.
Ora tutto ciò può aver influenzato sui problemi che ho riscontrato oppure sono dovuti prettamente al taglio? (il taglio lo faccio a -25°C e i campioni sono tenuti a -80°C inclusi in OCT)
Grazie :)
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supererry
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
82 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2012 : 17:34:05
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| Da quanto leggo sembra che il tessuto non sia assolutamente ben perfuso e probabilmente per questo motivo hai dei problemi a tagliare e attaccare a fettina. |
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FaFFi
Nuovo Arrivato
Prov.: MB
Città: Villasanta
9 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2012 : 14:45:32
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Ciao, dei dubbi sulla perusione è normale che tu te li faccia non avendola fatta di persona, ma ho alcuni suggerimenti che potrebbero esserti utili cmq:
1 hai gelatinato i vetrini prima di utilizzarli?permettono alla fetta di aderire per bene
2 l'OCT quando fai aderire la fetta al vetrino tende a diventare trasparente, ma anche se ne perdi un pezzo l'importante è che sul tuo vtrino ci sia la fetta completa
3 non ho mai sentito che i cervelli devono arrivare sul fondo della falcon..a me a volte capita e a volte no.
4 Dopo la perfusione io li tengo 24h in PFA 4% a 4°C, le successive 24h in saccarosio 30% e poi le metto direttamente in -80°C.
Al momento dell'utilizzo li prendo dal -80°C faccio una piccola impalcatura di OCT sul supporto e lo faccio congelare nel criostato a -25°C dopo di che mette qulache altra goccia e posiziono il cervello as econda della direzionalità delle fettine. lo metto nel criostato e aspetto qualche minuto che tutto sia a -25°C e poi inizio a tagliare. Io faccio fettine da 12 micronmetro quindi quasi la metà delle tue e così sono sempre riuscita a farle bene. in bocca al lupo! |
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Citosina
Nuovo Arrivato
Città: Milano
73 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2012 : 23:18:23
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Grazie per i consigli...vedrò di capire come perfondono meglio, per quanto riguarda le domande di faffi:
1 - no. Mi hanno sempre detto che i superfrost vanno bene così senza altri trattamenti. Nel caso però quale gelatina usi? Io in lab ho quella bovina di tipo B...la usavo per gelatinare le piastre per colture cellulari. Può andare bene? Se sì a che concetrazione la usi?
2 - Sì questo è vero, quello che intendo però è che appena si "scioglie" sul vetrino un emisfero del cervello si stacca dall'altro. (non accade spesso, però ho notato che succede con alcune fette nella parte più caudale fra l'ippocampo e prima del cervelletto)
3/4- E' come faccio io, soltanto che in genere prima faccio l'impalcatura in OCT e poi metto in ghiaccio secco e -80. Per la storia che i cervelli non debbano arrivare sul fondo: non so che dire, mi era stato spiegato che il passaggio in saccarosio serviva per far uscire l'acqua in modo tale da evitare la formazione di cristalli che poi tagliando si spezzano e bucano il tessuto. Il fatto che "affondino" indica che l'acqua è uscita. |
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Criostato
Didattica e Relazioni
