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stefysimo88
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 Inserito il - 21 novembre 2012 : 19:31:47
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Buonasera a tutti!!! sto mettendo a punto un protocollo per la migrazione delle cellule di glioma staminali tumorali con filtri transwell di 8 um.. Alcune domande: il coating io l'ho fatto con il matrigel per 10 minuti..è giudto?quante cellule piastrate per inserto e quanti ul ? io ho provato 10 000 cell/pz ma mi sembrano un po poche... e poi quanto incubate O/n? mi sembra un test molto empirico...per valutare la migrazione ho tagliato l'inserto, colorato con DAPI e letto al microscopio a fluorescenza..un giorno mi è andata bene ma oggi non c'era niente!! eppure ho contato le cellule nel pozzetto e qualcosa è migrato...boooh grazie x l'aiutoooo
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maross
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18 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2012 : 21:28:19
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Ciao, per il coating dipende...io non ho mai usato il matrigel, ma coating di polilisina o laminina, quindi sotto questo aspetto non so darti consigli. Per il numero di cellule da piastrare, che inserti hai? per multiwell da 24? I tempi di chemotassi sono variabili, a seconda dell'agente chemotattico che usi (e del tipo cellulare, ma anche nell'ambito dello stesso tipo cellulare può variare da campione a campione, poi per i gliomi non ne parliamo!) quindi devi fare delle prove per trovare la tua condizione "ideale", in modo tale da non avere filtri saturi che non ti consentirebbero di rilevare differenze fra controlli e stimolati. Io tendo ad evitare tempi lunghi, tipo on, perchè in quell'intervallo di tempo potrebbero proliferare e falsare l'esito del saggio. Qualcuno lo fa, usando antimitotici, ma sinceramente a me non piace particolarmente. Io mi sono mantenuto su range variabili dalle 3 alle 6 h.
Per la colorazione: perchè DAPI? hai filtri idonei alla fluorescenza? sennò, se sono i filtri "classici" basta una soluzione di coomassie R250 (se vuoi ti dò la ricetta in pm). Ma poi non ho capito, hai contato le cellule nel pozzetto? come le hai fissate?
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stefysimo88
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4 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2012 : 21:49:51
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Ciao!!! in questi giorni ho fatto un po di exp.. ho tolto il matrigel in modo da valutare solo la capacità delle cellule di migrare e non di invadere.. ho multiwell da 12 pz. Per ora ho visto che il tempo di 8 h non è male.. le cellule sul filtro le ho fissate, permeabilizzate e colorate con DAPI.. ma ora mi fai venire i dubbi ! Sinceramente ho seguito un protocollo che c'era in lab e magari si potevano colorare anche con il comassi..
quanto ne metti? mi daresti info? in effetti al microscopio a fluorecenza non è facile ditinguere le cellule migrate da quelle che stanno migrando e dai pori del filtro!... le cellule nel pz avrei voluto farne un saggio di vitalità MTS ma sono troppo poche e lo spettrofotometro non è abbastanza sensibile.. allora su consiglio del prof le ho recuperate centrifugate.. il pellet non si vedeva.. ho aspirato in modo da lasciare circa 2o ul e le ho contate in una camera di Burker.... ma la variabilità e la percentuale di errore sono enormi!!!aiutoo
grazie mille XD |
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maross
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18 Messaggi |
Inserito il - 11 dicembre 2012 : 10:24:19
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Citazione:
Messaggio inserito da stefysimo88
Ciao!!! in questi giorni ho fatto un po di exp.. ho tolto il matrigel in modo da valutare solo la capacità delle cellule di migrare e non di invadere.. ho multiwell da 12 pz. Per ora ho visto che il tempo di 8 h non è male.. le cellule sul filtro le ho fissate, permeabilizzate e colorate con DAPI.. ma ora mi fai venire i dubbi ! Sinceramente ho seguito un protocollo che c'era in lab e magari si potevano colorare anche con il comassi..
quanto ne metti? mi daresti info? in effetti al microscopio a fluorecenza non è facile ditinguere le cellule migrate da quelle che stanno migrando e dai pori del filtro!... le cellule nel pz avrei voluto farne un saggio di vitalità MTS ma sono troppo poche e lo spettrofotometro non è abbastanza sensibile.. allora su consiglio del prof le ho recuperate centrifugate.. il pellet non si vedeva.. ho aspirato in modo da lasciare circa 2o ul e le ho contate in una camera di Burker.... ma la variabilità e la percentuale di errore sono enormi!!!aiutoo
grazie mille XD
ciao. Allora sulle multiwell da 12 io di solito piastro un numero variabile da 150 a 500.000 cell/well a seconda delle cellule che ho a disposizione (lavoro con linee di GBM e anche con campioni provenienti da biopsia) e dell'entità di migrazione basale. A volte ho piastrato anche meno, perchè avevo poco materiale, ma in linea di massima quello è il range che ho trovato "ottimale" con tempi che variano dalle 3 alle 6h. L'ideale è trovarsi in una condizione "intermedia": il filtro non deve essere saturo (sennò non rilevi eventuali differenze), però anche un indice di migrazione troppo basso e quindi un numero troppo basso di cellule migrate per campo (non so tu come le conti, io di solito uso un 40X e conto una ventina di campi, salvo casi di grande variabilità e allora aumento il numero di campi che conto) porta a errori (e a una variabilità enorme) nella conta. Questa condizione la trovi facendo un po' di prove e variando i fattori densità di cellule piastrate e tempo di chemotassi.
Per la colorazione, che filtri usi? I fluoroblok o i filtri normali? Perchè i primi sono adatti alla fluorescenza, mentre gli altri no, quindi le difficoltà che riscontri potrebbero dipendere anche da questo. Su filtri normali (che sono anche più economici) basta lavare (per togliere il medium) con PBS e fissare con TCA (10% per 10'), poi "scrapi" la parte superiore e lavi (sempre con TCA) per allontanare i vari residui, immergi qualche secondo nella soluzione di Coomassie (se vuoi ti dò la ricetta), sciacqui in abbondante H2O bidist. e metti ad asciugare. Quando sono asciutti monti i filtri su vetrino e conti.Con il Coomassie la visualizzazione delle cellule che hanno migrato è generalmente molto chiara, a meno che non si sia scrapato male o non ci siano problemi di colorazione. In quest'ultimo caso comunque è anche possibile decolorare e ricolorare il filtro. |
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stefysimo88
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4 Messaggi |
Inserito il - 12 dicembre 2012 : 12:59:38
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Ciao!! i filtri sono i ThinCert della Greiner da 8 um.. sinceramente non ci siamo posti il problemi se fossero adatti alla fluorescenza.. tu sai già dirmi qualcosa in merito? il protocollo che ho seguito prevede:
lo screper delle cellule non migrate con un cotton fioc
il fissaggio del filtro in glutaraldeide al 3%(cos'è il TCA?) per 20'
2 lavaggi in PBS
aggiunta di Tryton allo 0,5 % per 10'
2 lavaggi in H20
taglio dell'inserto con bisturi e montaggio su vetrino
colorazione con DAPI per 5'
... sì, mi potresti comunque fornire la ricetta del coomassie? ma quindi prima di fissare i filtri li lavi?non perdi le cellule?
un' altra cosa: noi usiamo cellule staminali di glioma, le cresciamo in DMEM f12 con fattori di crescita. la sera prima dell'esp le starviamo in DMEM senza fattori e le piastriamo nel c negativo con lo stesso mezzo mentre il c positivo è addizionato del 10% di FBS. Tuttavia finora sembra che migrino addirittura maggiormente le cellule del c negativo! Abbiamo allora pensato di cambiare il c positivo e utilizzare mezzo addizionato di EGF, bFGF... ti sembra ragionevole? magari il siero ne cambia il comportamento...
Grazie infinite ;) |
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maross
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18 Messaggi |
Inserito il - 20 dicembre 2012 : 10:42:47
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Ciao, quei filtri non li conosco, ma a occhio direi che non sono per la fluorescenza e d'alra arte non è specificato. Io uso quelli della Falcon, in particolare quelli per la florescenza si chiamano Fluoroblok ( http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?prodId=365847&catyId=776835&page=product )...come vedi è specificato che sono adatti a questo tpo di colorazione (poi se leggi il manuale pdf trovi info più precise). Poi può anche darsi che qualcuno ci sia che usa i filtri "normali" per colorare con fluorescenza, ma io non l'ho mai fatto e non saprei che dirti in merito.
Per il resto, ti mando un pm ;) |
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