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Ababy
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
 Inserito il - 12 marzo 2013 : 00:34:16
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Ciao a tutti!
Da un paio di mesi sto facendo molti WB cercando di mettere a punto un Ab per una proteina che risulta essere evanescente praticamente in tutti gli estratti testati.
E' andato tutto bene finchč l'altro giorno non ho fatto la rilevazione dell'ultimo blot e la cui lastrina č risultata completamente bianca!
Il blot č stato reincubato, sia con primario che con secondario, per controllare di non aver sbagliato qualcosa ma il risultato č stato lo stesso. Ora, commettere lo stesso errore per due volte di fila č impossibile, considerato che tutti i blot precedenti non hanno avuto problemi.
Per verificare che non fosse un problema di Ab degradati, il blot č stato incubato con l'anti-actina ma mantenendo il secondario e come controllo č stato usato un blot vecchio che aveva dato un buon segnale. Mentre sul blot vecchio l'actina č stata rilevata senza problemi, questo non č stato possibile con la membrana in questione!
Abbiamo deciso di rifare da capo il gel e senza cambiare alcuna condizione il segnale della proteina che cerchiamo č venuto senza problemi.
Il problema sarebbe risolto se non fosse che č ricapitata la stessa cosa ma rilevando una proteina diversa, su altri estratti per uno scopo completamente diverso.
Qualcuno sa dirmi quali variabiali modificabili possono inficiare il risultato o ha almeno una vaga idea di cosa potrebbe essere successo??
Aggiungo che al termine del trasferimento il ponceau non aveva dato nessun segno che facesse pensare a qualcosa del genere.
(scusate se sono stata un po' prolissa e grazie in anticipo!)
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_ARY_
Nuovo Arrivato
Prov.: mi
Cittā: milano
81 Messaggi |
 Inserito il - 14 marzo 2013 : 21:27:20
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magari le soluzioni di sviluppo erano da rifare, comunque č meglio usarle a temperatura ambiente.
magari giā lo fai, ma per sapere se le proteine caricate sono anomale,se dopo colori la nitro con l'amido black ti assicuri che le proteine ci siano e le bande siano belle.
Sappi che il WB č un enigma infinito...anche a me alle volte capitano cose non spiegabili!
per il resto quando spiegherai le assurditā dei blot..spero ti diano un nobel :) |
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Ababy
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 14 marzo 2013 : 22:02:39
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I liquidi erano nuovi, ho anche provato a rimettere il substrato e anche un substrato di un'altra marca, niente, ha deciso che proteina non ce n'era!
E' curioso perchč rifacendo il gel poi improvvisamente la volta dopo viene!
Credo che abbiamo dei problemi con la riproducibilitā... |
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Blot che spariscono!
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