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vaneve
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2013 : 14:32:24
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Salve a tutti!
Mi sono trovata per la prima volta alle prese con una immunoprecipitazione (anzi, un pull-down) e sto avendo alcuni problemi.
La proteina da sottoporre al processo ha un tag di 6 istidine al C-terminale che viene legata da atomi di nichel. Mi è stato consegnato un kit vecchissimo con relativo protocollo scritto a mano non si sa da chi e quanto tempo fa...mi è stato comunque impossibile anche risalire al produttore del kit.
In ogni caso, la procedura prevede l'impaccamento della resina con diversi passaggi, compresa ovviamente l'aggiunta di nichel, in tubo da 1.5 ml.
Al momento dell'incubazione del campione, il protocollo prevede 5' a RT, ma mi è stato consigliato (da chi utilizzava lo stesso kit nello stesso lab almeno 10 anni fa) di farlo a 4°C ON in agitazione.
Il giorno dopo, seguo i passaggi del protocollo che mi permettono di recuperare il campione IP.
Al momento dell'eluizione, il protocollo prevede eluizioni multiple con 200 ul di buffer, ma mi è stato consigliato di eluire una sola volta in 50 ul di buffer, in modo da caricare poi sul gel tutto l'eluato.
La proteina che sottopongo al processo è di membrana e il mio campione è costituito da un lisato contenente membrane cellulari purificate.
Non sono riuscita a trovare riferimenti al rapporto tra resina e campione. Ho usato 200 ul totali di resina (incluso slurry, quindi 100 ul di resina) e il mio campione conteneva 50 ug di proteine in 50 ul.
Se voi ne sapete più di me, potreste darmi dei consigli riguardo al protocollo e al rapporto resina/campione, sia in termini di concentrazione che di volume?
Grazie mille.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2013 : 15:43:17
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Mamma mia, hai usato tantissima resina!
Ora non so quale sia la tua resina ed è un po' difficile dire quale sia esattamente la sua capacità di legame, ma una resina Ni-NTA in genere ha una capacità di 1-10mg proteina HIS-tag/ml di resina, poi varia molto da resina a resina, ma va beh non sapendo di quale si tratta teniamo questo valore.
Vuol dire che con 100ul di resina puoi legare circa 100ug-1mg di proteina His-Tag, se il tuo campione era di 50ug di proteine "totali" la resina che hai usato è veramente tanta.
Poi è importante anche il volume di campione che metti, il volume di campione deve essere "almeno" 2 volte il volume della resina, quindi x es. per 100ul di resina devi usare almeno 200ul di campione, 50ul sono veramente pochi.
Riguardo all'eluizione, il consiglio di fare un'unica eluizione non mi sembra affatto buono, sopratutto riducendo il volume di buffer! Non è affatto detto che la tua proteina si stacchi con la prima eluizione, dovresti prima fare una prova accertarti quando si stacca la tua proteina e poi casomai ridurre volumi e numero di eluizioni.
Infine mi ha lasciato molto perplessa sta cosa:
Citazione:
la procedura prevede l'impaccamento della resina con diversi passaggi, compresa ovviamente l'aggiunta di nichel
gli ioni di nichel in genere sono già legati alla resina, casomai la resina se riutilizzata più può essere rigenerata aggiungendo altro nichel, ma è un passaggio a parte, non si fa durante la purificazione!
Se puoi scrivici il protocollo che magari cerchiamo di capirci qualcosa di più, i dettagli così sono molto pochi.
Poi magari cerchiamo anche di capire di che resina si tratta, in che bottiglia è conservata? Ci sarà scritto qualcosa.
E sopratutto "di che colore è la resina"? Bianca o azzurrina? |
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vaneve
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2013 : 18:23:50
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Innanzi tutto grazie infinite perché già molti dubbi sono stati chiariti!
E mi confermi alcune cose che pensavo già.
La resina è di colore bianco. Durante la procedura di preparazione della resina, il protocollo (che ora non ho a portata di mano, ma cercherò di scrivere appena possibile) dice di aggiungere il "charge Buffer", di colore verde/azzurrino e contenente il nichel. Solo dopo questo passaggio la resina si colora!
Come dicevo, non mi è stato possibile risalire al tipo di kit, neanche dai contenitori: su tutti, compreso quello della resina, ci sono delle etichette scritte a mano con scritto il contenuto...
Lo so è una cosa tristissima...
Grazie mille ancora! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2013 : 21:10:12
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Se è un pull down non chiamarlo immunoprecipitazione.
Comunque mi interessa molto questa discussione, ergo domani, appena ripreso dalla due giorni di conferenze e alcol nella campagna francese mi accingerò a legger tutto pazientemente e dare il mio contributo.
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So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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vaneve
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2013 : 21:29:27
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Infatti hai ragione, è un pull down, ma tutti nel mio lab lo chiamano comunque immunoprecipitazione e le mie idee si confondono, soprattutto non avendo confidenza con la tecnica 
Riprenditi pure e aspetto con piacere il tuo contributo!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2013 : 17:51:47
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Citazione:
Messaggio inserito da vaneve
La resina è di colore bianco. Durante la procedura di preparazione della resina, il protocollo (che ora non ho a portata di mano, ma cercherò di scrivere appena possibile) dice di aggiungere il "charge Buffer", di colore verde/azzurrino e contenente il nichel. Solo dopo questo passaggio la resina si colora!
Ah ok, allora è in effetti una resina con NTA (o IDA, chi lo sa?) e devi caricarla con il nichel.
Va beh almeno questo lo abbiamo chiarito! 
Comunque ti consiglio di fare qualche prova per vedere le condizioni migliori in cui purificare la tua proteina, i rischi maggiori possono essere che tu non riesca ad eluirla tutta (e come ti dicevo una sola eleuizione potrebbe non bastare) o di recuperare anche altre proteine che non c'entrano niente ma che si possono legare agli ioni (motivo per cui è meglio non usare troppa resina).
Concordo appieno con 0barra1:Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Se è un pull down non chiamarlo immunoprecipitazione.
Citazione:
Messaggio inserito da vaneve
Infatti hai ragione, è un pull down, ma tutti nel mio lab lo chiamano comunque immunoprecipitazione e le mie idee si confondono, soprattutto non avendo confidenza con la tecnica
Se loro sbagliano non c'è motivo per cui debba farlo anche tu!
Tu continua a chiamarla correttamente pull-down e se qualcuno ti dovesse dire qualcosa del tipo: "devi fare una immunprecipitazione?" rispondi candidamente: "no devo fare un pull-down!"  |
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vaneve
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
Inserito il - 20 aprile 2013 : 21:55:24
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Grazie mille GFPina! Proverò a fare alcune prove e seguirò i tuoi consigli sui rapporti campione/resina e eluizioni.
Avete ragionissima sul pull down! |
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Immunoprecipitazione/Pull Down: problemi e consigli
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