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Chemical
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 Inserito il - 19 settembre 2013 : 12:58:34
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Ciao ragazzi. Chi mi sa dire come si estrae una proteina dai corpi d'inclusione? 
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lą
Utente Junior
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Inserito il - 19 settembre 2013 : 15:38:11
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ciao!
Ci sono diversi protocolli on-line per l'estrazione dai corpi inclusi.Li hai cercati? Io dovrei averne un paio da qualche parte,ma sono una rogna.
Hai provato invece a rendere la tua proteina pił solubile? |
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Chemical
Nuovo Arrivato
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Inserito il - 20 settembre 2013 : 01:20:16
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Hey, grazie per avermi risposto.  Dunque, si ho gią visto alcuni protocolli on line ma a me quel che serve per ora, č avere solo delle idee pił chiare su quelle che potrebbero essere le fasi coinvolte in un tipico processo di estrazione e purificazione di una proteina eterologa nei corpi di inclusione. Nulla di pił. 
E per fasi intendo, per esempio:
lisi cellulare; centrifugazione; elettroforesi; western blot; allestimento di proteina di fusione; cromatografia; ecc.. Insomma, capire l'ordine cronologico delle tecniche coinvolte in un tipico protocollo standard.  |
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lą
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2013 : 15:26:35
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Bč l'ordine cronologico č questo:
- lisi del pellet
- centrifuga
- raccogli e metti da parte il surnatante (se la tua proteina č solubile) o il pellet (da cui estrarrai la parte insolubile). Di solito si usano tamponi contenenti urea o la guanidina
- centrifughi e raccogli il surnatante
Ora puoi usare il surnatante appena raccolto per effettuare una cromatografia (quale sta a te decidere in base alle caratteristiche della proteina di interesse).
Poi fai un gel sds-page delle frazioni che hai raccolto dalla cromatografia ed un trasferimento del gel su membrana di nitrocellulosa per poi effettuare il tuo western con un anticorpo in grado di riconoscere la tua proteina.
Per all'estimento di proteina di fusione immagino tu intenda una proteina ricombinante che ha quindi un tag (GST, HA, istidina...), che userai per la tua cromatografia. In questo caso allora questo č il tuo punto di partenza: avrai il gene che inserirai in un vettore che esprimerą la proteina con il tag che preferisci (basta scegliere quale).
Questa č la scansione temporale, moooolto in generale.
Ciao!
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Chemical
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Inserito il - 22 settembre 2013 : 12:45:05
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Grazie sei gentilissima, era quello che mi interessava Solo su una cosa ho un ombra di dubbio, sul 3 punto da te elencato, quello che riguarda il pellet.
Nel caso quindi io avessi la proteina insolubile posso usare 2 modi:
- posso usare l'urea o il guanidinio per denaturarla, renderla solubile ed estrarla;
Oppure
- posso allestirla in proteina di fusione per renderla solubile e tramite il tag inserito posso separarla poi con la cromatografia.
Ho capito bene? Perchč a me interessa in particolare l'estrazione della proteina insolubile e quindi come renderla solubile per le successive analisi. |
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lą
Utente Junior
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Inserito il - 22 settembre 2013 : 14:07:17
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ti faccio un esempio.
Io avevo una proteina ricombinante (con un tag di 6 istidine nella sua parte N-terminale) che purtroppo non era solubile. Quindi ho dovuto trattare come ti ho detto il pellet (ho infatto usato un tampone con l'urea tra i componenti). Purtroppo la mia cromatografia č venuta uno schifo. Che fare quindi? Ci sono dei vettori che ti permettono (tramite un tag particolare) di rendere la una proteina pił solubile. Quindi ho clonato il gene per la mia proteina in un vettore che la esprime con un tag di MBP (maltose binding protein). In effetti cosģ la proteina era finalmente solubile e ben purificabile tramite cromatografia per affinitą.
Perņ non č finita qui. Ci sono altri modi per evitare di estrarre la proteina dai corpi inclusi. Per esempio puoi far crescere la tua coltura batterica durante l'induzione a basse temperature (io faccio circa 15°C O/N), puoi limitare la concentrazione di IPTG per l'induzione, puoi anche aggiungere glucosio al terreno.
Funzionano tutti i modi, lo so perchč li ho provati tutti.
Fammi sapere se non hai capito qualcosa |
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lą
Utente Junior
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Chemical
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Inserito il - 22 settembre 2013 : 17:32:35
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Perfetto, ora ho capito finalmente come si rende solubile la proteina Grazie
Un ultimissima cosa davvero. Ottenuta la proteina solubile, come la separo e la quantifico?
Hai menzionato cromatografia, poi sds-page e infine western-blot.
In base a cosa decido di usare l'una o l'altra? E quale puņ essere l'ordine cronologico delle tecniche? |
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lą
Utente Junior
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Inserito il - 24 settembre 2013 : 09:49:23
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Ti dico quello che faccio io.
La mia proteina ha un tag di 6 istitide. In generale quando hai una proteina con un tag procedi con una cromatografia per affinitą, cioč userai una colonna cromatografica che contiene una resina che ha un'alta affinitą di legame per il tag. Con l'istitida si una una resina col nichel per esempio. Una volta effettuata la cromatografia, per avere la certezza che la mia proteina ci sia, effettuo un western. Questo vuol dire che prima farņ un SDS-PAGE delle mie frazioni. L'SDS-PAGE č un gel denaturante, quindi le proteine correranno solo in base al loro peso molecolare (e tu devi conoscere quanto pesa la tua proteina). Poi trasferisci il gel su membrana e usi un anticorpo specifico contro la tua proteina (o il tag). Avrai un segnale, alla stessa altezza della tua proteina (per questo fai l'SDS-PAGE, cosģ hai appunto il riferimento del peso e sai dove guardare).
Finito, io procedo cosģ.
Poi ci sono altre metodiche per purificare la tua proteina oltre alla cromatografia per affinitą:ci sono colonne per scambio ionico (giochi sul pH in base al pI della tua proteina), per size exclusion (č la gel filtrazione e separi le proteine solo in base al loro peso), e altre resine ancora. Tutto dipende dalle caratteristiche della proteina che devi purificare. Di solito perņ io preferisco partire con una bella cromatografia per affinitą.
Spero di aver risposto bene. Se hai bisogno son qua.
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Chemical
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Inserito il - 25 settembre 2013 : 13:28:46
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Ok, ti ripeto l'ordine che ho capito :
-Lisi;
-Centrifugazione;
-Cromatografia;
-Elettroforesei su gel di poliacrilammide (sds-page);
-Western blotting.
Lo schema generale dovrebbe essere cosi, vero?
Quindi,
-Nel caso in cui avessi solubilizzato la proteina allestendola come proteina di fusione (es. con code di istidina), procedo con cromatografia di affinitą per il tag aggiunto, sds-page e infine western;
-Ma nel caso in cui avessi solubilizzato la proteina con urea o guanidina per estrarla dai corpi inclusi, procedo allo stesso modo o cambio strategia?
Poi so che ci sono dei controlli per testare l'avvenuta espressione proteica ai tempi con l'induttore. E' la stessa cosa oppure č un altra fase? Ed eventualmente č obbligatoria o facoltativa? E dove si colloca cronologicamente parlando?
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lą
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2013 : 18:11:42
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Se la estrai dai corpi inclusi, procedi allo stesso modo.
Per quanto riguarda i controlli di espressione, questi si fanno prima di ogni cosa! Ovviamente, perchč devi capire diverse cose per ottimizzare l'espressione, ovvero:l' OD (densitą ottica) della tua coltura; la quantitą di IPTG da utilizzare; la temperatura con cui fa procedere l'induzione, e la sua durata. Queste sono condizioni essenziali. Che devi trovare PRIMA di tutto. |
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Chemical
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Inserito il - 28 settembre 2013 : 11:34:38
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| Va bene. Ti ringrazio per tutte le risposte date e l'immensa pazienza che hai avuto. Dovrebbero farti una statua in tuo onore solo per questo Ciao e grazie ancora |
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lą
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 28 settembre 2013 : 13:03:07
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Estrazione proteine dai corpi d'inclusione
Didattica e Relazioni
