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Excelinthewall
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
 Inserito il - 03 ottobre 2013 : 22:10:00
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ciao a tutti! mi affido a voi come ultima risorsa perchè io sono disperata e frustata. VI spiego il problema: i miei western non vengono, ovvero quando vado a sviluppare le lastre sono bianche. Riassumendo il protocollo in somme righe, le proteine sono corse su gel precasted al 12% di Acry, vengono blottate a 15 V per 23 minute, e sulla nitrocellulosa ora ottenuta ci faccio il red ponceau, che mi fa osservare che le proteine ci sono. sempre, mi viene che ho le proteine (quindi per questo dubito che il problema che ho sia dovuto alla corsa)
ora blocco per 2 h room temperature in milk o BSA (5% T-TBS 0,1%) e poi metto l'anticorpo I over night a +4°C. il giorno dopo recupero il AbI, lavo con T-TBS 0.05 % e metto il secondario (spesso anti rabbit a concentrazioni che possono variare da 1:10 000 a 1:20 000) in milk o BSA, per 1h RT. dopo di ciò lavo nuovamente con T-TBS, e metto l'ECL per 1-2'. sviluppo.
ho cambiato tutto e pensato di tutto. in primis ho rifatto gli anticorpi primari, niente lo stesso. preso un nuovo secondario, idem. rifatto sempre il milk nuovo, nulla. L'unica cosa che ho cambiato è i lucidi tra cui mettiamo le membrane da sviluppare (eprchè finiti li sto comprando da buffetti) ma oggi ho provato con la pellicola trasparente, ma assolutamente nulla. Non applico più lo stripping buffer perchè penso sia troppo violento. per l'ECL manco, è nuovo ed è il westar nova 2011 che tutti usano. Ciò che noto è che, per esempio, ieri avevo due membrane, oggi le ho sviluppate (una beata ceppa) e ho rifatto il rosso ponceau per scrupolo e notavo che AVEVO PARTI DI MEMBRANA SENZA NULLA! O_O
help help help! oggi stavo per piangere!!! ç_ç
grazie!
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 03 ottobre 2013 : 22:48:52
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Due domande per iniziare:
1) qual è il peso molecolare delle proteine che vuoi osservare?
2) non riesci a visualizzare niente? Neanche il gene housekeeping che utilizzi per normalizzare? |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Excelinthewall
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2013 : 09:19:11
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in questo periodo sto cercando iNOS (130 kDa) e COX2 (70 kDa). neppure il mio house keeping viene (B actina tra 40-50 kDa). naturalmente taglio le membrane per fare iNOS e COX2 sulla stessa membrana.
Ab I di iNOS è in BSA 1% T-TBS 0,1 %, diluizione 1:9000
Ab I di COX2 è in BSA 5% T-TBS 0,1 %, diluizione 1:1000
house keeping, Ab I b actina, 1:10 000 nin milk 5% T-Tbs 0.1% |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2013 : 12:01:50
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| controlla il pH delle soluzioni. Poi, come sviluppi? manualmente o con sviluppatrice automatica? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Excelinthewall
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 04 ottobre 2013 : 12:38:57
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sviluppo manualmente con liquidi di sviluppo e fissativo della kodak.
potrebbe essere un problema di pH?
il T-TBS lo facco utilizzando 1 l di acqua bidistillata + 2 pastiglie di TBS già comprate (1 pastiglia è per 500 ml di acqua) e il Tween alla concentrazione che mi serve (0.05% o 0,1%) |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2013 : 01:41:45
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Che livello di concentrazione massima di Ab sei arrivato a provare?
Quante proteine carichi? Le denaturi prima della corsa? E a quanti gradi?
Il buffer di trasferimento qual è?
Controlla effettivamente il pH delle soluzioni, e prova a ripreparare il TBS (magari in maniera alternativa alle pastiglie) o prova ad utilizzare il PBS.
iNOS è un po' pesante e quindi si potrebbe ragionare anche sul trasferimento (magari prova in wet, cambia il tampone o aumenta tempi e/o voltaggi).
Però il fatto che non esca niente, neanche di leggero, esclude che sia solo un problema di dimensioni.
Certo, sarebbe da vedere quanto effettivamente vengono blottate le proteine.
Hai provato a colorare anche il gel nel post-corsa e vedere quanta roba resta su?
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Excelinthewall
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2013 : 09:52:44
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di quale concentrazione di Ab parli? I o II?
dato che sono lisati di cellule, carico 30ug. Per denaturazione penso che sia lo step in cui metto il lisato + sample buffer (il colorante con blu di bromofenolo, DTT, running buffer 1X e glicerolo) a bollire per 3' in acqua in ebollizione (ergo 100°C).
il buffer di trasferimento è quello che facciamo noi, con trizma, glicina, MetOH al 20% e SDS. La ricetta non la ho qui :'( sorry!
comunque ieri non sono andata in lab causa influenza, ma ho lasciato le mie membrane a un mio compagno. effettivamente qualcosa è uscito!!! O_O l'unica cosa che avevo rifatto erano le soluzioni di lavaggio (T-TBS 0,05 %)...
ho provato a fare le colorazioni con blu di comassie (possibile?) e rimaneva qualcosa, ma poco, in rapporto al red ponceau sulla nitro cellulosa. il tempo di blottaggio lo sto aumentando solo per pmTOR che sta a 290 kDa.
mi sorge quindi il dubbio: se ora l'unica cosa cambiata è il T-TBS...possibile che sia quello il problema ora? ma perchè a luglio invece non veniva proprio nulla? noi pensavamo a una reazione con ECL e fogli lucidi per proiettore... |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 07 ottobre 2013 : 09:05:04
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Citazione:
Messaggio inserito da Excelinthewall
di quale concentrazione di Ab parli? I o II?
dato che sono lisati di cellule, carico 30ug. Per denaturazione penso che sia lo step in cui metto il lisato + sample buffer (il colorante con blu di bromofenolo, DTT, running buffer 1X e glicerolo) a bollire per 3' in acqua in ebollizione (ergo 100°C).
il buffer di trasferimento è quello che facciamo noi, con trizma, glicina, MetOH al 20% e SDS. La ricetta non la ho qui :'( sorry!
comunque ieri non sono andata in lab causa influenza, ma ho lasciato le mie membrane a un mio compagno. effettivamente qualcosa è uscito!!! O_O l'unica cosa che avevo rifatto erano le soluzioni di lavaggio (T-TBS 0,05 %)...
ho provato a fare le colorazioni con blu di comassie (possibile?) e rimaneva qualcosa, ma poco, in rapporto al red ponceau sulla nitro cellulosa. il tempo di blottaggio lo sto aumentando solo per pmTOR che sta a 290 kDa.
mi sorge quindi il dubbio: se ora l'unica cosa cambiata è il T-TBS...possibile che sia quello il problema ora? ma perchè a luglio invece non veniva proprio nulla? noi pensavamo a una reazione con ECL e fogli lucidi per proiettore...
Mi riferivo ad entrambi gli anticorpi.
Se cambiando il T-TBS la situazione migliora, potrebbe essere quello il problema. Prova ad ottimizzarlo ora basandoti su questo nuovo T-TBS che avete preparato.
Effettivamente anche l'ECL potrebbe essere. Non ho capito il fatto della reazione ECL-fogli lucidi...
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La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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Excelinthewall
Nuovo Arrivato
15 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2013 : 20:45:36
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allora problema finalmente risolto... è L'ECL!!!!! utilizziamo il westarn nova 2011, che, secondo il datasheet può essere preparao alla luce, messo alla luce con la variante che quando devi ibridare con la membrana, deve essere al buio. in pratica io facevo tutto sopra e poi mi facevo 3 piani per andare nella camera oscura a sviluppare: ci mettevo 5-10 minuti. Leggendo il protocollo c'è scritto che cc'è un picco di chemioluminescenza che però varia da Ab a Ab. quindi perdendo 10' di esposizione, ho perso tutti i segnali perchè probabile che i miei Ab danno il picco subito... ora faccio l'ECL in camera oscura e le cose vengono. inoltre, ho giocato anche con i blocchi, diminuendo sia la concentrazione di milk (o BSA) e il tempo... stanno incominciando a venire!!
grazie a tutti!!! |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2013 : 08:59:23
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Ottimo!
Troppo bello giocare col western!!! :D |
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Excelinthewall
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15 Messaggi |
Inserito il - 16 ottobre 2013 : 22:08:54
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Citazione:
Messaggio inserito da Luis 22
Ottimo!
Troppo bello giocare col western!!! :D
se lo dici tu XD
io sto impazzendo! XD
ahahahaha |
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Discussione |
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Cambiato tutte le variabile ma i western non vengono!
Didattica e Relazioni
