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IlariaLNCIB
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 Inserito il - 19 maggio 2014 : 15:17:42
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Salve a tutti,
sto cercando di preparare una colonna per purificare un anticorpo. La proteina che fungerà da antigene, o meglio una sequenza della proteina, è fusa alla GST nella porzione N-terminale.
L'estrazione della mia rGST da batteri BL-21 è buona, ma appena dopo l'incubazione del lisato con la resina (GSH-sepharose), quest'ultima appare a "flocculi", compattandosi in agglomerati di varie dimensioni, da molto piccole a più grosse. Aggiungendo del DTT tutto torna omogeneo e senza grumi.
Il problema si presenta di nuovo nel momento del cross-linking della resina-GSH alla proteina-GST. Il protocollo prevede questi passaggi:
1) Lavare 2 volte con tetraborato di Sodio (Na2B4O7) pH9.
2) Risospendere la resina in tetraborato di Sodio con 20mM di DMP, pH9. Lasciare 45 minuti a RT in agitazione (su ruota meccanica).
3) Lavare 2 volte con etanolammina 0,2 M pH8. (!!! ECCO che qui si riformano i grumi!! ) A questo punto ho provato a riaggiungere DTT 50mM, ma la situazione non è migliorata. 
Avete qualche suggerimento?
Grazie 
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Antybody purification:crosslinking of the RESIN-GSH to rGST
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