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biotecalessia
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
 Inserito il - 10 aprile 2015 : 11:11:48
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Ciao a tutti, vi scrivo poiche' vorrei chiedervi un aiuto. Sto effettuanto il clonaggio ed espressione di alcuni geni, chiamate OBPs, presenti negli afidi. Sono arrivata alla digestione del DNA plasmidico con BamHI e HindIII (usano lo stesso buffer)e la banda dei miei geni, dopo corsa elettroforetica, non e' molto intensa quindi rischio di avere una concentrazione molto bassa dopo la purificazione del gel. Al momento ho 5 campioni per ogni DNA plasmidico ~100ng/uL.
E' possibile unire questi 5 campioni in modo da ottenere un campione piu' concentrato?
Usero il vettore di espressione pET45b ma non ho idea della casa produttrice, posso usare il kit di ligazione e di digestione che ho usato rispettivamente col vettore di clonaggio(pGEM)e con il DNA plasmidico?
Grazie in anticipo :)
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0barra1
Utente Senior
Cittā: Paris, VIIčme arrondissement
3847 Messaggi |
 Inserito il - 10 aprile 2015 : 16:28:59
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normalmente per una ligazione uso 50-100 ng di vettore e una 30ina di inserto (a seconda del rapporto di dimensione con il vettore). Dovresti avere sufficiente materiale, senza concentrare nulla.
usa tranquillamente il kit di digestione per il vettore, se insorgono problemi te ne renderai conto al momento di verificare su gel l'avvenuta linearizzazione del plasmide. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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biotecalessia
Nuovo Arrivato
85 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2015 : 12:55:21
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per la ligazione faro' cosi' pero' la concentrazione dei miei inserti dopo la purificazione del gel e' veramente bassa!
Inserto1= 3,7ng/uL
Inserto2= 9,1ng/uL
Inserto3= 4ng/uL
pET45b= 31,4ng/uL
Inserto 2 credo vada bene, ma 1 e 3 non credo!
Vorrei chiedervi e' possibile modificare la reazione di digestione? Se la reazione di base e':
2uL Buffer
1uL BamHI
1uL HindIII
xuL plasmidic DNA
xuL H2O .... TOT=10uL (thermo scientific)
ho pensato di mettere:
4uL Buffer
1,5uL BamHI
1,5uL HindIII
24uL plasmidic DNA
9uL H2O.... TOT=40uL
Va bene questa mix anche se non ho rispettato le proporzioni?
Grazie mille
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